Медицински гъби като източник на анти-туморни и имунно-модулиращи полизахариди

S.P. Wasser[1]

Резюме:

На Земята съществуват 140 000 броя гъби, обаче само 10% са познати (приблизително 14 000 именувани сорта). Гъбите са голям и все още твърде неизползван източник на силни нови фармацевтични продукти. По-специално, и най-важно за съвременната медицина, те са неограничен източник на полизахариди с анти-туморни и имунно-стимулиращи свойства. Много, ако не и всички гъби Basidiomycetes съдържат биологично активни полизахариди в плодните тела, култивирани мицели, бульон. Събрани са данни за гъбните полизахариди от 651 сорта и 7 инфраспецифични таксони от 182 сорта higher Hetero- и Homobasidiomycetes. Тези полизахариди са с различен химичен състав, повечето спадащи към групата на β-глюкани; те имат β-(1→3) връзки в основната верига на глюкан и допълнителни β-(1→6) разклонени точки, необходими за анти-туморната им дейност. Глюканите с високо молекулно тегло изглежда са по-ефективни от онези с ниско молекулно тегло. Често се извършва химична модификация, за да се подобри анти-туморната дейност на полизахаридите и техните клинични качества (най-често водоразтворимост). Основните процедури, използвани за химично подобряване, са: разграждане на Смит (oxydo-reducto-hydrolysis), формолиза и карбоксиметилация. Повечето от клиничните данни за анти-туморното действие идват от търговските полизахариди лентинан, PSK (krestin), и schizophyllan, но полизахариди от някои други обещаващи сортове медицински гъби също показват добри резултати. Тяхното действие е особено полезно в клиниките, когато са използвани в комбинация с химиотерапия. Гъбните полизахариди предотвратяват онкогенезис, показват пряка анти-туморна действие срещу различни алогенни и сингенни тумори, и предпазват от туморни метастази. Гъбните полизахаридите не атакуват раковите клетки директно, а произвеждат анти-туморните си ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Анти-туморното действие на полизахаридите изисква непокътнат компонент на Т-клетка; тяхната дейност се предава през thymus-зависим имунен механизъм. Практичното приложение зависи не само от биологичните свойства, но също и от биотехнологичната наличност. Настоящият преглед анализира характерните свойства на полизахаридите, извлечени от плодните тела и мицела (двата основни метода на биотехнологично производство днес) в избрани примери на медицински гъби.

Въведение

Хилядолетия наред гъбите са били ценени от човечеството като хранителен и медицински източник. В много сортове гъби бяха открити някои биоактивни молекули, вкл. анти-туморни съставки. Полизахаридите са най-добре известните и най-силни гъбни съставки с анти-туморни и имунно-модулиращи свойства (Mizuno 1996, 1999a, b, 2002; Lorenzen and Anke 1998; Borchers et al. 1999; Ooi and Liu 1999; Wasser and Weis 1999; Tzianabos 2000; Reshetnikov et al. 2001). Исторически, разтворимите в гореща вода (декокции и есенции) фракции от медицински гъби, т.е. най-вече полизахариди, са използвани като лекарство в далечния Изток, откъдето основно произхождат познанията и практиката на използване на гъби (Hobbs 1995, 2000). Гъби като Ganoderma lucidum (Reishi), Lentinus edodes (Shiitake), Inonotus obliquus (Chaga) и много други са стотици години събирани и използвани в Корея, Китай, Япония и източна Русия. Тези практики все още са в основата на съвременните научни изследвания на медицинските действия на гъбите, особено в областта на рака на стомаха, простатната жлеза и белите дробове. Забележително и удивително е колко са надеждни фактите, събрани от традиционната източна медицина в изследването на медицинските гъби (Ying et al. 1987; Hobbs 1995, 2000; Wasser and Weis 1997a, b, 1999; Stamets 2000). Ikekawa et al. (1969) е публикувал един от първите научни доклади върху анти-туморните действия на есенции, добити от плодните тела на гъби, принадлежащи към семейство Polyporaceae (Aphyllophoromycetideae) и някои други семейства, проявени като вътрешно посредническо действие срещу присаден рак – като Сарком 180 – в животни (Ikekawa et al. 1982, 1992; Ikekawa 2001). Скоро след това са развити първите три основни медикамента от медицински гъби. И трите бяха полизахариди, по-специално β-глюкани: krestin от култивирана мицелна биомаса на Trametes versicolor (Turkwey Tail), лентинан от плодните тела на L. Edodes (Shiitake), и schizophyllan от течно култивирания бульон от Schizophyllum com­mune (Split Gill). През последните почти 40 години медицинските гъби са интензивно изследвани за медицински ефекти в модели на системи ин виво и ин витро, а много нови анти-туморни и имунно-модулиращи полизахариди бяха открити и използвани в практиката (Mizuno 1996, 1999a; Wasser and Weis 1999; Ikekawa 2001). Биологично активните полизахариди са широкоразпространени сред гъби higher Basidiomycetes, а повечето от тях имат уникални структури в различни сортове. Нещо повече, различни щамове на един и същи сорт Basidiomycetes могат да произведат полизахариди с различни свойства. Например, протеоглюкан krestin е разработен в Япония от щама Trametes (Coriolus) versicolor CM-101, а полизахарид-пептид (PSP) в Китай е разработен в потопена култура на щама Cov-1 от същия сорт. И двата протеоглюкана имат същия полизахариден компонент, но с различни протеинови молекули към полизахарида (Hiroshi and Takeda 1993). Настоящата статия анализира анти-туморните и имунно-модулиращи полизахариди от гъби higher Basidiomycetes. Отделено е повече внимание на общите им черти, отколкото на специфичните им характеристики. Статията резюмира общото състояние на познанията в областта на биоразнообразието на гъби и техните полизахариди; химическата структура на полизахаридите и връзката й с тяхната анти-туморна дейност, вкл. възможни начини на химична модификация; резултати от експериментални тестове и клинично използване на анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди; възможни механизми на биологичното им действие; и накрая, разликата в състава на полизахаридната фракция при плодните тела и чиста култура мицел в избрани примери на изследваните медицински гъби.

Голямото количество и разнообразие на гъби с анти-туморни полизахариди

Общият брой на описаните фунги от всички видове в момента е поне 80 060 сорта; това е число, получено като сбор на броя на сортовете във всеки род, дадени в последното издание на Речник на фунгите (Kirk et al. 2001). Това число включва всички организми, традиционно изучавани от микологистите: тинеста плесен, chromistan фунги, chytridiaceous фунги, лишейни фунги, нишковидни фунги, плесени и закваски. Терминът „гъби” обикновено означава определението на Chang and Miles (1992): „макрофунга с характерно плодно тяло, което може да е или хипогенно, или епигенно, достатъчно голямо да се види с просто око и да се пипне с ръка”. Броят на нишковидните фунги, които са гъби в смисъла на това определение, извлечен от Речника на фунгите, е поне 14 000, а може даже 22 000 (Hawksworth 2001). Реалният брой на тези сортове на Земята, обаче, без съмнение е много по-висок. Двете основни причини за много по-големия реален брой са: (1) големият брой все още неизследвани сортове, и (2) фактът, че толкова много морфологично определени „сортове” гъби се оказват групи от няколко биологични сортове (Hawksworth 2001). Повечето нови гъби са открити в тропиците, по-специално онези сортове, които формират ectomycorrhizas с местните дървета. В различните тропически области 22-55% (в някои случаи до 73%) от сортовете гъби са неописани (Hawksworth 2001). Анализ на местностите, където новите за науката фунги са описани и каталогизирани в Индекса на фунгите през 10-те години от 1990 до 1999г., разкри, че около 60% от всички новоописани фунги са от тропиците (Hawksworth 1993, 2001); такъв е случаят също за гъби, въпреки че нови сортове продължават да се откриват в Европа и Северна Америка. Изследвания на съвместимостта и молекулните поредици между гъбите, смятани преди от един и същи сорт по морфологични причини, разкриха „тайни сортове”, например популации, функциониращи като отделни биологични сортове, но определени с едно научно име. Отделен морфологично определен сорт може да съдържа 20 или повече биологични сорта (Hawksworth 2001). Имайки предвид всичко това, скорошни изчисления на броя на фунгите на Земята варира от 500 000 до 9.9 млн. сорта, само 80 060 от които имат имена. Обикновено се приема работно число от 1.5 млн. сорта, а нови данни показват, че това не е безразсъдно. Броят на гъбите на Земята се определя на 140 000, от които може би само 10% са известни. В същото време от тези приблизително 14 000 сорта, известни днес, около 50% са смятани за притежаващи различни степени на ядливост, повече от 2 000 са безопасни, а около 700 сорта притежават значителни фармакологични свойства (Chang 1999; Wasser and Weis 1999; Reshetnikov et al. 2001). Следователно, очевидно е, че гъбите представляват огромен и в същото време все още неизследван източник на мощни нови фармацевтични продукти. Higher Basidiomycetes гъби са неограничен източник на анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди. Всички основни таксономични групи гъби са били изследвани за биологично активни полизахариди, и повечето от тях притежават тези съставки. Поне 651 сорта и 7 инфраспецифични таксони, представящи 182 рода Hetero- и Homobasidiomycetes гъби съдържат анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди, както се вижда от табл. 1, Приложение 1 (адаптирана от Reshetnikov et al. 2001). Естествено събрани или изкуствено отгледани плодни тела, чисти мицелни култури, и филтратни култури (бульонни култури), всички те съдържат биологично активни полизахариди.

Процедури по пречистване на полизахаридите

След две десетилетия интензивни изследвания на медицинските гъби Mizuno и колегите му от Япония разработиха надеждни процедури за успешна екстракция, фракциониране и пречистване на полизахариди от плодните тела или мицелни култури. По принцип тази схема включва елиминиране на съставките с ниски молекулни тегла от гъбния материал, използвайки 80% етанол, следвано от три успешни екстракции с вода (100°C, 3 ч.), 2% амониев оксалат (100°C, 6 ч.), и 5% натриев хидроксид (80°C, 6 ч.) (Mizuno 1996, 1999a). Резултатите от първата екстракция са водоразтворими полизахариди, а от другите две – водонеразтворими полизахариди. Извлечените полизахариди са по-нататък пречистени чрез комбинация от техники, като етанолова концентрация, фракционно утаяване, киселинно утаяване, йоннообменна хроматография, гелова филтрация, и афинитетна хроматография. По принцип, йоннообменната хроматография чрез DEAE-целулозни колони разделя неутралните полизахариди от киселинните. Тогава неутралните полизахариди са разделени на α-глюкани (погълната фракция) и β-глюкани (непогълната фракция) с помощта на гелова филтрация и афинитетна хроматография. Същата процедура с киселинните полизахариди (след извличане с 1 M NaCl) води до пречистени полизахариди (Mizuno 1999a). Основните схеми за фракционни препарати на полизахариди от гъби са показани схематично на фиг. 1, Приложение 2. Трябва да се отбележи, че всяка схема на процедурата на фракциониране зависи във всеки случай от полизахаридния състав на извлечения материал.

Структурен състав на анти-туморните полизахариди в гъбите

Полизахаридите принадлежат към структурно разнообразни макромолекули, полимери на монозахаридни остатъци, обединени помежду си чрез гликозни връзки. Заслужава си да се отбележи, че в сравнение с други биополимери, като протеини и нуклеидни киселини, полизахаридите предлагат по-голям капацитет на пренасяне на биологична информация, защото имат най-голям потенциал за структурно разнообразие. Нуклеотидите в нуклеидните киселини и аминокиселините в протеините могат да се свързват само по един начин, докато монозахаридните единици в полизахаридите могат да се свързват в различни точки, за да формират широко разнообразие от клонирани или линейни структури (Sharon and Lis 1993). Това огромно потенциално разнообразие в полизахаридната структура дава необходимата гъвкавост за прецизните регулиращи механизми на различни взаимодействия клетка-клетка в по-висшите организми. Гъбните полизахариди присъстват най-вече като глюкани с различни видове гликозни връзки, като (1→3), (1→6)-β-глюкани и (1→3)-α-глюкани, но някои са изцяло хетерогликани. Другите в повечето случаи се свързват с протеинови остатъци като PSP комплекси (PSPC; Gorin and Barreto-Berger 1983). Основният източник на анти-туморни полизахариди изглежда са стени на фунгова клетка, състоящи се от полизахариди. Обаче хитин и хитозан (fungal chitin) нямат анти-туморно действие (Mizuno et al. 1995b). β-D-глюканът е полизахарид, произвеждан основно от D-глюкоза чрез киселинна хидролиза (Mizuno 1996, 1999a). Колкото до структурата на третичния строеж на schizophyllan, активен β-D-глюкан има тройно-нишкова дясно-спираловидна структура (Marchessault et al. 1977). Acidic glucuronoxylomannan, изолиран от плодното тяло на Tremella fucifor­mis, също има ляво ориентирана, тройно-спираловидна гръбначна форма (Yui et al. 1995). Освен добре познатите анти-туморни β-(1→3)-глюкани, широк кръг биологично активни глюкани с други структури са описани. Тези полизахариди имат линейни или разклонени молекули в гръбнака, съставени от α- или β-свързани единици глюкоза, и съдържат странични вериги, прикрепени по различни начини. Хетероглюкан странични вериги съдържат глюкозна киселина, ксилоза, галактоза, маноза, арабиноза, или рибоза като основен компонент или в различни комбинации. Изследвани са широк кръг анти-туморни или имунно-стимулиращи полизахариди с различна химична структура от Висшите Базидиомицети; основните видове са представени на табл. 2, Приложение 1. Броят на анти-туморните активни фракции в плодните тела на гъбите е забележително висок. Един пример може да се види в анализ на полизахариди на плодни тела на Pleurotus pulmonarius (= P. sajor–caju): 16 полизахаридни фракции от 21 екстракции показаха различни нива на анти-туморно действие (Zhuang et al. 1993, табл. 3, Приложение 1). Най-активните анти-туморни водоразтворими фракции от P. pulmonarius са Fi_o-a протеин-съдържащ ксилоглюкан с Man:Gal:Xyl:Glc в полизахарида при моларно съотношение 2:12:42:42, а FA-2 протеин-съдържащ манногалактан с Xyl:Man:Gal (9:35:56 моларно съотношение). Най-активните анти-туморни водонеразтворими полизахариди са FII-1 протеин-съдържащ ксилан; FIII-1a протеин-съдържащ глюкоксилан с Glc:Xyl (40:44 моларно съотношение), и FIII-2a протеин-съдържащ ксилоглюкан с Xyl:Glc (36:62 моларно съотношение).

Корелация на структурата и анти-туморните действия на гъбните полизахариди

Полизахаридите с анти-туморно действие се различават много по своя химически състав и конфигурация, както и по своите физически свойства. Анти-туморното действие се показва чрез широк кръг от гликани, варирайки от хомополимери до много сложни хетерополимери (Ooi and Liu 1999). Разликите в свойствата могат да бъдат съпоставени с разтворимостта във вода, размера на молекулите, степен и форма на разклоняване. Въпреки че е трудно да се съпостави структурата и анти-туморното действие на сложните полизахариди, могат да се направят някои връзки. Очевидно е, че за анти-туморното действие са необходими структурни характеристики като β-(1→3) връзки в основната верига на глюкан и допълнителни β-(1→6) разклонени точки. β-глюканите, съдържащи основно (1→6) връзки, имат по-слабо действие. Изглежда глюканите с високо молекулно тегло са по-ефективни от тези с ниско молекулно тегло (Mizuno 1996, 1999a, b). Наблюдават се също обаче очевидни различия в анти-туморните полизахариди. Анти-туморните полизахариди могат да имат други химични структури, например хетеро-β-глюкани (Mizuno et al. 1995b), хетерогликан (Gao et al. 1996b), β-глюкан-протеин (Kawagishi et al. 1990), α-мано-β-глюкан (Mizuno et al. 1995b), α-глюкан-протеин (Mizuno et al. 1995b) и хетерогликанпротеин комплекси (Zhuang et al. 1993; Mizuno et al. 1996). Известно е, че β-(1→3)-глюкани на медицинските гъби с тройно-спираловидното третично устройство са важни за имунно-стимулиращото им свойство. Когато лентинан беше денатуриран с диметил сулфоксид, урея, или натриев хидроксид, третичната структура се изгуби, докато основната структура не се повлия, но свойствата на задържане на тумора бяха намалени с прогресивна денатурация (Maeda et al. 1988). Същите резултати, потвърждаващи корелацията между анти-туморното действие и тройно-спираловидната структура, бяха получени при изследване на schizophyllan (Yanaki et al. 1983, 1986). Гъбните β-(1→3)-глюкани показват много биологични и имунно-фармакологични действия, много от които, като макрофаг азотен оксид синтез, и limulus factor G активиране, са зависими от тройно-спираловидното устройство, докато други не са зависими от него, например синтез на интерферон-γ и фактор на стимулиране на колония (Yadomae 2000), показвайки, че α-(1→3)-манната гръбначна структура е по-важна от третичната структура на молекулата. За разлика от β-(1→3)-глюкани с медицински свойства, които са силно зависими от високо молекулно тегло от 500 до 2,000 kDa (Mizuno 1996), α-(1→3)glucuronoxylomannans, характерни за желираните гъби, не са силно зависими от молекулното тегло. По този начин Gao и колегите му (1996a) докладваха, че киселинни хидролизатни фракции на плодните тела на T. fuciformis съдържат glucuronoxylomannans с молекулни тегла от 53 до 1 kDa, които карат човешките моноцити да произвеждат интерлеикин-6 толкова ефикасно, колкото нехидролизиран хетерополизахарид. Това показва, че действието може да се дължи на общата структура на α-(1→3)-манния гръбнак; разликите в молекулното тегло нямат видно въздействие върху действието на хетерогликани (Gao et al. 1996b).

Активиране на гъбните полизахариди чрез химична модификация

В литературата са описани различни методи за подобряване анти-туморното действие на гъбните полизахариди чрез химична модификация. Най-успешните схеми за химично подобряване на гъбните полизахариди са разработени за Ganoderma lucidum (Reishi), Grifola frondosa (Maitake) and Leucopaxillus giganteus (= Tricholoma gigantea). Тези схеми включват две основни процедури: модификация на гъбните полизахариди чрез разграждане на Смит (oxydo-reducto-hydrolysis) и активиране чрез метода на формолизата (Mizuno 1996, 1999a; Mizuno et al. 1996). По метода на разграждане на Смит бяха подготвени пет полиалдехиди и десет полиалкохоли от пет полизахаридни фракции, преди това добити от течна мицелна култура на G. Frondosa (Maitake). По тази причина оригиналните полизахаридни разтвори бяха първо оксидирани чрез полиалдехиди 0.1 M NaIO₄ на тъмно, после превърнати в полиалкохоли чрез намаляване на NaBH₄ в алкална среда, нагласена за pH 8 с 2 M NaOH, и хидролизирана с 1 M H₂SO₄ на стайна температура (Zhuang et al. 1994b). Химичното активиране на гъбни полизахариди по метода на формолизата включва разграждане на полизахаридите чрез мравчена киселина в 99% HCOOH разтвор; тогава реагиралият разтвор се утаява с 99% EtOH, и половината от утайката е лиофилизирана след диализа, докато другата половина е разтворена в гореща вода и допълнителни фракции, получени от алкохолно утаяване (Zhuang et al. 1994b). По този метод бяха подготвени четири формилирани полизахариди и четири полизахаридни продукта на формолиза от четири полизахаридни фракции от течна мицелна култура на G. frondosa. Въпреки че два от оригиналните полизахарида нямаха никакво действие, техният полиалдехид полиол, формилирани и формолизирани производни, показаха значително действие. Полиалдехид и полиол-полизахариди, приготвени от полизахарид с ниско анти-туморно действие, показаха по-високо действие от оригиналния полизахарид (Zhuang et al. 1994b). Тъй като всички оригинални полизахаридни фракции, показващи повишени нива на действие чрез химична модификация, бяха β-глюкан или ксилоглюкан, беше предположено, че захарната верига се е променила или е била премахната при третирането, давайки резултат в подобрена разтворимост и действие (Mizuno 1999a). Карбоксиметилация е другият химичен метод, използван за трансформиране на β-глюкани във водоразтворима форма. Например, цели плодни тела на Pleurotus ostreatus или техни парчета бяха третирани с разтвор на 0.15 M натриев хидроксид при 95°C за 2 ч. Събраният остатък беше измит с вода докато стане неутрален, след това суспендиран в разтвор от 0.06% натриев хлорит, нагласен на pH 4.5 с мравчена киселина, и разбъркан за 6 ч. при 50°C. Полученият полизахарид беше β-(1→3)-свързан глюкан, а всеки четвърти глюкопираносил остатък заместен с 0–6 с единични D-глюкопираносил групи. Хетерогенната етерификация на прахообразния глюкан с монохлорооцетна киселина (C₂H₃ClO₂) в алкална среда даде натриева сол на производно на водоразтворим O-(карбоксиметил) глюкан (Kuniak et al. 1993; Karácsonyi and Kuniak 1994). Карбоксиметилираният глюкан от Pleurotus ostreatus (pleuran) показа имунно-модулиращи ефекти, особено засилено фагоцитно действие (Paulik et al. 1996). По същия начин водонеразтворим алкалноразтворим линеен α-(1→3)-глюкан, получен от плодните тела на Amanita muscaria и Agrocybe aegerita, имаше малък или никакъв ефект, докато техните карбоксиметилирани продукти показаха потенциално анти-туморно действие (Kiho et al. 1994; Yoshida et al. 1996). Химична модификация на разклонени гъбни полизахариди, водещи до намаление на страничната верига, могат да се получат не само чрез разграждане на Смит, а също и чрез ензимни реакции. След успешни ензимни третирания на потопена течна култура с амилаза, целулоза и протеаза, беше получен нов линеен полизахарид, съдържащ α-(1→4)-свързани α-D-глюкозни единици с молекулни тегла от 500–10,000 kDa (Kosuna 1998). Линейни α-(1→4)-глюкани с ниско молекулно тегло, получени след ензимно намаляване на страничните вериги и протеинов компонент (активни хексозо-свързани съединения (active hexose correlated compounds – AHCC)) показаха, че имат имунно-модулиращи и анти-туморни свойства (Ghoneum et al. 1995; Matsushita et al. 1998). През 1992г. в Япония беше направен опит да се увеличи профилактичния ефект на AHCC срещу повторна поява на хепатоклетъчен карцином след хирургична намеса (Kidd 2000). Сулфатираните хомо- и хетерополизахариди, притежаващи антивирусно действие, са широкоразпространени в algae, особено в морско algae (Schaeffer and Krylov 2000), но не се срещат в природата в гъби higher Basidiomycetes. Химично сулфатираните schizophyllans с различно съдържание на сяра бяха получени от β-(1→3)-глюкан, произведен от Schizophyllum commune (Itoh et al. 1990; Hirata et al. 1994). Беше предположено, че съдържанието на сяра в schizophyllan е по-важно за задържане растежа на вируса на имунната недостатъчност (HIV), отколкото молекулното тегло или природата на захарния компонент (Itoh et al. 1990; Hobbs 1995). Медицинските тестове показват, че сулфатираният schizophyllan със сярно съдържание 5% може да се използва като анти-HIV агент за третиране на хемофилици, заразени с HIV (Hirata et al. 1994; Hobbs 1995). Важно е да се разбере, че химичната модификация е необходима в много случаи, за да подобри не само анти-туморното действие на гъбните полизахариди, а също и клиничните им качества, най-важните от които са водоразтворимост и възможност за проникване през стомашните стени след орално поглъщане.

Тестване на анти-туморното и имунно-модулиращо действие на гъбните полизахариди

Първоначалните данни за анти-туморното действие на гъбните екстракти бяха косвени и по никакъв начин стабилни и надеждни. В същото време много косвени данни, които бяха правилно събрани и обработени, дадоха добри доказателства за полезните ефекти на гъбите върху човешкото здраве. Добър пример е епидемилогичното изследване в префектура Нагано, Япония, където действието беше наблюдавано за няколко десетилетия. Изследователите показаха, че раковата смъртност на фермери, отглеждащи Flammulina velutipes (добре известна медицинска гъба в Япония), беше забележително по-ниска от тази на останалото население в префектурата (Ikekawa 1995, 2001). Друго подобно наблюдение в Бразилия предизвика обширни изследвания – и популярност – на Agaricus blazei (вж. по-долу). Бих искал да подчертая принципните моменти на анти-туморните и имунно-модулиращите ефекти на гъбните полизахариди. Най-важните от тях са: (1) предпазване от онкогенезис чрез орално приемане на гъби или техни препарати; (2) пряко анти-туморно действие срещу различни алогенни и сингенни тумори; (3) имунно-засилващо действие срещу тумори в комбинация с химиотерапия; (4) предпазен ефект при туморни метастази. Японски изследователи дават добър пример за предпазния ефект на тяхната известна ядлива и медицинска гъба Hypsizygus marmoreus (Ikekawa 2001). Контролни мишки бяха хранени на обикновена диета, а третирани мишки – с диета, съдържаща 5% сухо плодно тяло на H. marmoreus. Всички мишки бяха интраперитонално инжектирани със силен карциноген, метилхлорантрен, а карциногенезисът беше изследван. На края на 76-та седмица от наблюдението 21 от 36 контролни мишки развиха тумори, а от третираната група – само 3 от 36 мишки. Авторите заключиха, че механизмът на действие на ядливите гъби да задържат рака и предпазват от рак се дължи на имунно засилване (Ikekawa 2001). Добре известно е от клиничната практика, че гъбните полизахариди работят най-добре заедно с други форми на „тежка” химиотерапия и операция, които за съжаление са много агресивни и имат много отрицателни странични ефекти. В това отношение върху животински модели и в човешката клинична практика най-добре е изследван лентинанът. При едно изследване 275 пациенти с напреднал или повтарящ се стомашен рак бяха третирани с една от два вида химиотерапия (митомицин C с 5-флуороурацил или тегафур) или самостоятелно, или с инжекции лентинан. Най-добрите резултати бяха получени, когато лентинан беше администриран преди химиотерапията и при пациенти с първично поражение, които не са преминали през предишни химиотерапии. Резултатите бяха оценени въз основа продължителност на живот, регресия на туморите или пораженията, и подобряване на имунните отговори (Hamuro and Chihara 1985; Hobbs 1995; Wasser and Weis 1997a). Метастазът е много сериозен и важен проблем в терапията на рака. Профилактичният ефект на гъбните екстракти върху раков метастаз бяха изследвани от много групи, особено в Националния изследователски институт с раков център в Япония. В поредица от успешни експерименти Lewis белодробен карцином беше Schwann-клетъчно трансплантиран във възглавничките на лапите на мишките и EA6 или EA6-PII (полизахариди от Flammulina velutipes) бяха следоперационно администрирани за период от 10 дни. Продължителността на живот на групата, третирана с EA6-PII, беше значително удължена (Ikekawa 2001). По-нататъшно изследване беше проведено с Meth-A фибросарком: 7 дни след като туморът беше Schwann-клетъчно трансплантиран в корема на женски BALB/c мишки, плътният тумор от всяка мишка беше хирургично изваден, а 7 дни след операцията беше направен втори опит със същия тумор, Meth-A фибросарком, като беше Schwann-клетъчно трансплантиран в другата страна на корема на мишката, и растежът на тумора от повторния опит беше изследван. Резултатите показаха, че предварителното третиране с EA6 леко задържа растежа на повторния тумор, но пост-третирането беше забележително ефективно за задържане растежа на тумора при доза 10 mg/kg (Ikekawa 2001). Бяха извършени много тестове на специфични препарати от определени гъби върху животински модели и в клиники. След като Chihara изолира лентинан от Lentinus edodes през 1969 г., повечето от експерименталното анти-туморно тестване беше извършено с този полизахарид. Неговият баща, самият Chihara, беше един от първите изследователи, които обявиха анти-туморните свойства на лентинана. Първоначално неговият ефект беше тестван използвайки Сарком 180, имплантиран в CD-1/ICD мишки (Chihara et al. 1969, 1970). По-късно лентинан показа очевидно анти-туморно действие не само срещу алогенни тумори, а също и срещу различни сингенни и автохтонни тумори (Hamuro and Chihara 1985). Инжекции лентинан върху мишки доведоха до 80% намаление на туморния размер или пълна регресия в повечето тествани животни (Chihara 1981). Последваха много клинични тестове. Един от първите такива беше продължително, произволно контролно изследване на пациенти във Фаза 3 на напреднал или повторен рак на стомаха (Wasser and Weis 1999; Ikekawa 2001). Терапията с лентинан показа много добри резултати в удължаване продължителността на живот на пациентите и нямаше токсични странични ефекти. Подобни резултати бяха получени при пациенти с колоректален рак и рак на гърдата. Оттогава лентинан се превърна в широкоизползвано лекарство и хранителна добавка в Япония, други страни в Далечния Изток, а по-късно в САЩ и Европа. PSK (търговско име krestin) има забележително имунно-засилващо действие и широк антинеопластичен обхват. Той удължава времето на оцеляване на облъчени мишки, стимулира фагоцитозното действие на макрофагите, и подобрява функциите на ретикулоендотелната система (Zhu 1987). Що се отнася до анти-туморните му свойства, той действа пряко на туморните клетки, както и косвено в приемника, засилвайки клетъчния имунитет (Hobbs 1995; Stamets 2000). Той е показал анти-туморно действие в животни с аденосарком, фибросарком, мастоцитома, плазмацитома, меланома, сарком, карцином, и рак на гърдата, дебелото черво и белия дроб (Sugimachi et al. 1997). Интересна черта на това съединение е, че инжекция с PSK в един туморен обект задържа туморното развитие в други обекти, така предпазвайки от метастази. PSK е използван орално и интравенозно в клиничната медицина. Той се оказа ефективен срещу много видове рак (Hobbs 1995; Stamets 2000), но рядко със задоволителни резултати, ако се прилага самостоятелно. Полизахаридът schizophyllan показва анти-туморно действие срещу плътни и ascite форми на Сарком 180, както и срещу плътната форма само на Сарком 37, Erlich сарком, Yoshida сарком и Lewis белодробен карцином (Hobbs 1995). Schizophyllan засилва клетъчния имунитет чрез възстановяване на подтиснатото действие на убиване на клетки до нормални нива в мишки с тумори (Borchers et al. 1999). Най-добрите резултати срещу поражение от облъчване бяха открити, когато schizophyllan беше прилаган скоро след или заедно с облъчването, а schizophyllan възстанови митозата на клетките на костния мозък, подтиснати от антираковите лекарства (Zhu 1987). Клиничните изследвания върху хора показаха полезното действие на лечението с schizophyllan за пациенти с повторен и неоперируем рак на стомаха, етап 2 шиен рак, и напреднал шиен карцином (Hobbs 1995).

Механизми на анти-туморно и имунно-модулиращо действие с гъбни полизахариди

Гъбните полизахариди проявяват анти-туморното си действие предимно чрез активиране на имунния отговор на организма на приемника. Тези съставки са смятани за модификатори на биологичния отговор (biological response modifiers – BRMs; Wasser and Weis 1999). Това основно означава, че те: (1) не предизвикват вреда и не поставят допълнителен стрес върху тялото; (2) помагат на тялото да се адаптира към различни биологични и други стресове, присъщи на средата; и (3) прилагат неспецифично действие върху тялото, поддържайки някои или всички основни системи, вкл. нервна, хормонална и имунна система, както и регулиращите функции (Brekhman 1980). Имунно-модулиращото действие на гъбните полизахариди е особено ценно като профилактична, лека и неагресивна форма на лечение, както и при профилактика от метастазни тумори, и др., описани по-горе. Полизахаридите от гъби не атакуват пряко раковите клетки, а произвеждат техни анти-туморни ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Това беше доказано в много експерименти, например загубата на анти-туморния ефект на полизахариди в неонатални thymectomized мишки или след администриране на анти-лимфоцитен серум (Ooi and Liu 1999). Тези резултати предполагат, че анти-туморното действие на полизахаридите изисква незасегнат компонент на T-клетка, и че действието се предава чрез имунен механизъм, зависещ от тимуса. Освен това, анти-туморното действие на лентинана и други полизахариди е забавено чрез предварително третиране с антимакрофагни агенти (като карагенан). Така че, смята се, че различните ефекти на полизахаридите се дължат на засилване на отговора на предшестващи Т-клетки и макрофаги към цитокини, произведени от лимфоцити след специфично разпознаване на туморните клетки (Hamuro and Chihara 1985). Като допълнение, въвеждането на подчертано увеличение в количествата на CSF, IL-1, и IL-3 от полизахариди водят до узряване, разграничаване и разпространение на имунно-способните клетки за защитни механизми на приемника (Hamuro and Chihara 1985). Гъбните полизахариди са известни като стимулатори на естествените клетки убийци, Т-клетки, В-клетки, и отговорите на имунната система, зависима от макрофаги. Лентинан е известен с възможността си да възстановява подтиснатата дейност на помагащите Т-клетки в приемника, притежаващ тумор, до нормалното им състояние, водещо до пълно възстановяване на хуморални имунни отговори (Ooi and Liu 1999). Същият ефект важи за PSK, докато той няма съществени ефекти върху имунните отговори в приемника при нормални условия. Инфилтрацията на еозинофили, неутрофили и гранулоцити около целевите тъкани също се засилва от лентинан. Той активира отделянето на активен кислород и производството на цитокини в перитонеалните макрофаги. Лентинан увеличава също цитотоксичността на перитонеалните макрофаги срещу метастазни тумори; той може да активира нормалните и алтернативни пътеки на допълнителната система и може да раздели C3 на C3a и C3b, засилвайки активирането на макрофаги (Aoki 1984; Wasser and Weis 1997a; Hobbs 2000). Имунно-активиращата способност на лентинана може да се свърже с неговата модулация на хормонални фактори, които играят роля в туморния растеж. Aoki (1984) показа, че анти-туморното действие на лентинана е силно намалено с администриране на тироксин или хидрокортизон. Лентинанът може също да възстанови специфичната за тумора анти-ген ориентирана реакция на хиперчувствителност от забавен тип. Schizophyllan активира макрофагите (ин витро и ин виво), което води до засилване действията на Т-клетките и увеличава чувствителността на цитотоксични LAK и NK клетки към IL-2 (Mizuno 1996). Въпреки че е структурно свързан с лентинана, schizophyllan не активира пряко Т-клетките (Hobbs 1995). Възможните пътеки на такива действия на лентинана са описани в Chihara (1981) и Hamuro and Chihara (1985), и прегледани от Wasser and Weis (1999), а тези за β-D-глюкан BRMs (Mizuno 2002) са показани на фиг. 2 и фиг. 3, Приложение 2.

Избрани примери на важни медицински гъби с анти-туморни полизахариди в плодните тела и култивирания мицел

Нашата група изследва един от най-важните ядливи и медицински биотехнологични сорта, известен като A. blazei. Анализът на данните за култивираната гъба, произхождаща от Бразилия, и изследването на типов материал от A. blazei Murrill показват драматични разлики между тях. На основата на съществуващи различия беше предложено правилното име на ширококултивираната гъба да бъде нов за науката сорт Agaricus brasiliensis (S. Wasser et al). A. blazei е северно-американският ендемичен некултивиран сорт, известен само от три местности – една във Флорида и две в Южна Каролина (Wasser et al. 2002). Гъбата Agaricus blazei (the Royal Sun Agaricus, ABM, Himematsutake, Cogmelo de Dues) е една от по-новооткритите медицински гъби. Вкусната ядлива гъба произхожда от много малка област в планините на Бразилия, близо до град Сан Пауло. Епидемиолозите, изучаващи местното население в тази област, откриха, че те имат много малко случаи на болестно разнообразие, вкл. рак, както и вирусни и бактериални болести, а непропорционално голям брой от тях се радват на дълголетие. В последствие това беше свързано с постоянното консумиране на гъбата A. blazei в нормалното хранене. През 80-те и 90-те години на ХХ век A. blazei показа, че е стимулант на имунната система, карайки естествените защитни механизми на тялото да се борят с много инфекциозни агенти и условия, например рак. Имунно-стимулиращото и анти-туморно действие на екстрактите от A. blazei беше изследвано в различни лабораторни модели, включващи мишки, носещи тумори на Сарком 180 и (Meth-A) фибросарком (Kawagishi et al. 1989, 1990; Mizuno et al. 1990b, 1998; Mizuno 2002; Itoh et al. 1994; Ebina and Fujimiya 1998; Fujimiya et al. 1998a, 2000; Stamets 2000). От 17 полизахаридни фракции, получени от плодните тела на A. blazei (Mizuno et al. 1990a; Mizuno 2002), 7 показаха анти-туморно действие. Анализите на физико-химичните свойства на водоразтворимите полизахаридни фракции с високо анти-туморно действие показаха, че техните основни компоненти бяха β-(1→6)-; β-(1→3)-глюкан, acidic β-(1→6)-; α-(1→4)глюкан, и acidic β-(1→6)-; α-(1→3)-глюкан (Mizuno et al. 1990a). A. blazei беше първата гъба, описана, че съдържа анти-туморен глюкан с β-(1→6)-свързан гръбнак, за разлика от добре известните β-(1→3)-глюкани. Анти-туморният протеоглюкан HM3-G от плодните тела на A. blazei, който предизвиква активиране и апоптоза на естествени клетки убийци, има молекулно тегло 380 kDa и съдържа повече от 90% глюкоза, а основният компонент е α-(1→4)-глюкан с β-(1→6)-разклоняване, при съотношение приблизително 4:1 (Fujimiya et al. 1998b). Интересно е да се отбележи, че фракция с ниско молекулно тегло, LM-3, със средно тегло 20 kDa, съставена от α-(1→4)-глюкан с β-(1→6)-разклоняване, също демонстрираше туморно-специфични цитоубийствени и имунно-засилващи ефекти (Fujimiya et al. 1999), докато чист глюкан, получен от анти-туморен β-(1→6)-глюкан-протеин комплекс, изолиран от водонеразтворим остатък от плодни тела на A. blazei, не показа силно действие (Kawagishi et al. 1990). Три имунно-стимулиращи хетероглюкани (AG-2, -3, и -6) бяха получени с 0.9% натриев хлорид и гореща вода от плодните тела на A. blazei от шестте получени полизахариди (Cho et al. 1999). AG-2 и AG-3 съдържаха глюкоза, галактоза и маноза в морални съотношения съответно 74.0:15.3:10.7 и 63.6:17.6:12.7; а AG-6 се състоеше от глюкоза и рибоза в морално съотношение 81.4:12.6. Ксилоглюкан (Xyl:Glc, морално съотношение =2:10), съдържащ 9% протеин, получен чрез фракционизиране и пречистване на екстракт от A. blazei, показа съществено действие срещу Сарком 180 при мишки (Mizuno 2002). Не само плодните тела, а и култивираният мицел от A. blazei, са източник на анти-туморни полизахариди. Анти-туморна органична съставка, наречена ATOM, беше получена от A. blazei (Iwade strain 101), която е PSPC (Ito et al. 1997). Друг PSPC, 0041, беше получен от потопена мицелна култура; основните компоненти на този полизахарид са глюкоза и маноза (Hikichi et al. 1999). Наскоро беше отделен нов анти-туморен полизахарид срещу Сарком 180 от течен култивиран мицел на A. blazei: β-(1→2)-; β-(1→3)-глюкоманан (Tsuchida et al. 2001). Този полизахарид изглежда напълно различен от анти-туморните полизахариди от плодните тела на A. blazei (Mizuno et al. 1999b). Филтрат във водна среда, отделен от мицел след потопено култивиране на A. blazei, съдържаше манан-протеинов комплекс (AB-FP) с молекулно тегло 10⁵–10⁷ Da и малко количество глюкоза, галактоза и рибоза. Добивът на AB-FP беше 575 мг/1 филтрат във водна среда, и съдържа съществено анти-туморно действие (Mizuno 2002). Следователно, анти-туморните полизахариди, изследвани в плодното тяло на A. blazei, мицелни култури или произведени екстраклетъчно в културна среда, имат различни химични структури. Полизахаридите от плодните тела показаха глюкани с различни видове връзки на единици глюкоза или хетероглюкани; мицелните култури съдържаха глюкоманани, а манан-протеинови комплекс беше произведен в културна среда при потопено култивиране. Ganoderma tsugae е друга медицинска гъба, чиито полизахариди са добре изследвани и в плодното тяло, и в мицела. От 14 водоразтворими и 15 водонеразтворими фракции от плодните тела на G. tsugae, бяха получени 7 гликани със силни анти-туморни действия (Wang et al. 1993). Водоразтворимите фракции бяха протеин-съдържащи глюкогалактани, свързани с маноза и фукоза, а водонеразтворимите фракции представяха протеин-съдържащи β-(1→3)-глюкани с различно протеиново съдържание. От мицела на G. tsugae бяха получени 16 водоразтворими полизахариди и изследвани за анти-туморни ефекти върху Сарком 180 при мишки (Zhang et al. 1994b). Получените 3 активни полизахариди бяха: гликан-протеинов комплекс, съдържащ 9.3% протеин, с хетерополизахарид, съставен от маноза and ксилоза; a глюкан-протеинов комплекс, съдържащ 25.8% протеин; и гликан-протеин с глюкоза като основен компонент, и свързан с арабиноза, маноза, ксилоза и галактоза. Сравнение на активни водоразтворими полизахариди, получени от плодно тяло и мицел, показаха, че тези от плодното тяло бяха глюкогалактанпротеин комплекси, а тези от мицел бяха хомоглюкан-протеинови комплекси или хетерогликан, съставен от маноза и ксилоза. Grifola frondosa е една от най-популярните медицински гъби. Плодните тела на тази гъба съдържат β-(1→3)-; β-(1→6)-глюкан, acidic β-D-глюкан (Mizuno et al. 1986; Jong and Birmingham 1990; Wasser and Weis 1999), и β-(1→6)-; β-(1→3)-глюкан (Nanba et al. 1987) във водоразтворима полизахаридна фракция. Водонеразтворими фракции включват acidic ксилоглюкан с Glc:Xyl моларно съотношение 100:82 и 16.5% глюкуронова киселина; acidic хетерогликан, съдържащ 3.8% протеин, компонентна захар Glc:Xyl:Man:Fuc (100:58:34:14); и три acidic гликопротеини с молекулни маси 20–100 kDa. Основната компонентна захар е глюкоза, докато фукоза, ксилоза, маноза и галактоза са второстепенни компоненти (Mizuno et al. 1986). Следователно, всички полизахариди, открити в плодните тела на G. frondosa, са β-глюкани с различно устройство на веригата, хетероглюкани, или глукопротеини. За разлика от състава на полизахарида в плодното тяло, не са открити β-глюкан сред анти-туморните активни фракции, получени от културен мицел (отгледани върху Whatman филтърна хартия, напоена с течна хранителна среда), събран преди началото на плодните тела (Mizuno and Zhuang 1995). Във водоразтворимите фракции бяха открити фукогалактоманан-протеинов комплекс, глукогалактоманан, маногалактофукан, и галактоглукоманофукан-протеинов комплекс. Във водонеразтворими фракции бяха открити манофукоглукоксилан, маноглукофукоксиланпротеин комплекс, манофукоглукоксилан-протеинов комплекс, и глукоманофукоксилан-протеинов комплекс (Zhuang et al. 1994a). Следователно, полизахариди от G. frondosa са хетероманани, хетерофукани и хетероксилани, или техни комплекси с протеини, т.е. видове полизахариди, които не бяха намерени в плодните тела на тази гъба. Трябва да кажем, че полизахаридната структура в култивирания мицел може да зависи от структурата на хранителната среда, използвана за култивиране. Така Ohno и колеги (1985, 1986) стигнаха до извода, че анти-туморният глюкан грифолан, получен от култивиран мицел на G. frondosa, е β-(1→3)-, β-(1→6)-глюкан, същият като този в плодното тяло на гъбата. В този експеримент чиста култура беше отгледана в течна среда в стационарна култура или с клатене. Полученият мицел беше допълнително култивиран за 3 дни в buffer, състоящ се от глюкоза (5%) и лимонова киселина, pH 4.5. Анти-туморно активните β-(1→3)-, β-(1→6)-глюкани бяха получени чрез екстракция на мицел, отгледан в хранителна среда и чрез алкохолно утаяване на buffer supernatant (Adachi et al. 2002). Броят на полизахаридите, получени от плодни тела или култивиран мицел от същия сорт, зависи много от използвания метод на фракцинизиране, но по принцип общият брой на полизахаридите в плодните тела е по-висок (вж. табл. 4, Приложение 1). Броят на фракциите, показани на табл. 4, включва в някои случаи не само окончателно пречистени полизахариди, а и някои междинни фракции, които бяха тествани за анти-туморно действие. Съотношението на биологично активни полизахаридни фракции в плодни тела и култивиран мицел е много високо. Така 20 от 29 полизахаридни фракции, получени от плодното тяло на G. frondosa, показаха различни нива на анти-туморно действие (Mizuno et al. 1986), а 24 от 29 полизахаридни фракции, получени от култивиран мицел на същата гъба, показаха анти-туморно действие (Zhuang et al. 1994a). Общият брой на полизахаридите, получени от плодното тяло, по принцип е по-висок от тези, получени от култивиран мицел. Например, общо водоразтворимите и водонеразтворими полизахариди, получени от склеротум на I. obliquus, са 2-3 пъти повече от тези, получени от култивиран мицел (вж. табл. 5, Приложение 1).

Заключение

Higher Basidiomycetes гъби са все още далеч недостатъчно изследвани; дори списъкът с известните сортове е непълен, включващ може би само 10% от реалния брой съществуващи сортове (Hawksworth 2001; Kirk et al. 2001). Броят на гъбите с известни фармакологични качества е още по-малък. Въпреки всичко сортовете, изследвани досега, представляват голям източник на анти-ракови и имунно-стимулиращи полизахариди. Много, ако не всички гъби Basidiomycetes съдържат биологично активни полизахариди. От 651 сорта и 7 инфраспецифични таксони от 182 вида higher Hetero- и Homobasidiomycetes, огромно мнозинство съдържат фармакологично активни полизахариди в плодни си тела, култивирани мицели или култивиран бульон (Reshetnikov et al. 2001). Гъбните полизахариди имат различен химичен състав, предимно принадлежащи към групата на β-глюкани (Mizuno 1999a, 2000). Анти-туморните полизахариди от различни гъби са обособени според техните молекулни тегла, степен на разклоняване и по-висока (третична) структура. Очевидно е, че такива структурни характеристики като β-(1→3) връзки в основната верига на глюкан и допълнителни β-(1→6) разклонени точки са необходими за анти-туморното действие. β-глюканите, съдържащи предимно (1→6) връзки, имат по-слабо действие. Глюканите с високо молекулно тегло изглежда са по-ефективни от тези с ниско молекулно тегло (Mizuno 1996, 1999a, b). За разлика от β-(1→3)-глюкани, α-(1→3)-glucuronoxylomannans, които са характерни за желираните гъби, не зависят много от молекулното тегло. Съществуват различни подходи за подобряване анти-туморното действие на гъбните полизахариди чрез химична модификация, която е необходима и за подобряване на техните клинични качества, разтворимост във вода и възможност за проникване през стомашните стени след орално поглъщане. Двете основни процедури за химично подобряване са: модификация на гъбните полизахариди чрез разграждане на Смит (oxydo-reductohydrolysis) и активиране чрез метода на формолиза. Най-успешните схеми за такива методи са били разработени за Ganoderma lucidum, Grifola frondosa и Leucopaxillus giganteus (= Tricholoma gigantea). Карбоксиметилация е друг химичен метод, който трансформира β-глюкани във водоразтворима форма. Голям брой експериментални и клинични данни показват полезните резултати на гъбните полизахариди за следните цели: (1) предпазване от онкогенезис чрез орално консумиране на гъби или техните препарати; (2) пряко анти-туморно действие срещу различни алогенни и сингенни тумори; (3) имунно-засилващо действие срещу тумори заедно с химиотерапия; (4) превантивни ефекти върху туморни метастази. Повечето от клиничните данни идват от търговските полизахариди лентинан, PSK (krestin), и schizophyllan, но съществуват също забележителни нови данни за полизахариди от Phellinus linteus, Flammulina velutipes, Hypsizygus marmoreus, A. blazei и други. Биохимичните механизми, които пренасят биологичното действие на полизахаридите, са все още недостатъчно изучени. Полизахаридите от гъби не атакуват раковите клетки пряко, а произвеждат техни анти-туморни ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Анти-туморното действие на полизахаридите изисква непокътнат компонент на Т-клетки; тяхното действие се пренася чрез имунен механизъм, зависещ от тимуса (Borchers et al. 1999). Гъбните полизахариди са известни като стимулиращи естествените клетки убийци, Т-клетки, В-клетки и макрофаг-зависещи отговори на имунната система. Имунно-модулиращото действие на гъбните полизахариди е особено ценно като средство за профилактика, лека и неагресивна форма на третиране, предпазване от метастазни тумори и като лечение заедно с химиотерапия. Сред higher Basidiomycetes гъби са открити много биологично активни полизахариди, а тяхното практическо приложение зависи не само от уникалните им свойства, а и от биотехнологичната наличност. Изолацията и пречистването на полизахариди от гъбен материал са сравнително лесни и ясни, и могат да се извършват с минимални усилия (Mizuno 1996, 1999a). Мицелите, формирани от отглеждане на чисти култури в потопени условия, са с постоянен състав, а потопената култура е най-добрата техника за получаване на правилни и безопасни гъбни продукти (Wasser et al. 2000; Reshetnikov et al. 2001).

Приложение 1

Таблица 1

Гъби higher Basidiomycetes, съдържащи анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди

Таблица 2

Химична структура на анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди от higher Basidiomycetes

Таблица 3

Структура и анти-туморно действие на полизахариди от плодни тела на Pleurotus pulmonarius срещу Сарком 180 в мишки (според Zhuang et al. 1993). FI–FA водоразтворими, FII–FIII водонеразтворими полизахариди

Таблица 4

Брой полизахаридни фракции, получени от различни Basidiomycetes

^a Брой фракции само от водоразтворими полизахариди

Таблица 5

Добив на полизахаридни фракции от склеротуми и мицелна култура на Inonotus obliquus (според Mizuno et al. 1999b)

Приложение 2

Фигура 1

Фракционно приготвяне на полизахариди от гъби (адаптирано от Mizuno (1999a) с модификация)

Фигура 2

Възможни пътища на действие на Лентинан (според Chihara 1981)

Фигура 3

Възможен имунен механизъм: β-D-глюкан модификатор на биологичен отговор (МБО; BRM) (според Mizuno 2002)