(Nerve Growth Factor-Inducing Activity of Hericium erinaceus in 1321N1 Human Astrocytoma Cells)

Невротрофичните фактори са от изключително голямо значение за поддържане и функционална организация на невроните. Ето защо при лечението на невродегенеративни болести като болестта на Алцхаймер се очаква да се прилагат субстанции, наподобяващи невротрофичен фактор или техните индуктори. В настоящото проучване ние първо изпитахме ефекта на етанолови екстракти от четири ядливи гъби, Hericium erinaceus (Yamabushitake), Pleurotus eryngii (Eringi), Grifola frondosa (Maitake), и Agaricus blazei (Himematsutake) върху генната експресия на неврорастежния фактор (NGF) в човешки астроцитомни клетки 1321N1. От четирите екстракта от гъби, само екстрактът от H. erinaceus промотира mРНК експресия на NGF в количество, зависещо от концентрацията на екстракта. Освен това, екстрактите от Hericium erinaceus засилваха секретирането на NGF от клетки 1321N1, а екстракт от H. erinaceus, инкубиран с клетки 1321N1, засилваше растежа на невритите на клетки PC12. Съставките на H. erinaceus, хериценони C, D и E обаче не успяха да промотират генна експресия на NGF в клетки 1321N1. Усилването на генната експресия на NGF от екстракти от H. erinaceus беше инхибирано от инхибитора на c-jun N-терминалната киназа (JNK) SP600125. Освен това, екстрактите от H. erinaceus индуцираха фосфорилиране на JNK и произхождащата от нея субстанция c-Jun и засилваха експресията на c-fos, което показва, че H. erinaceus промотира генната експресия на NGF чрез JNK сигнализиране. Нещо повече, ние изследвахме ефикасността на H. erinaceus in vivo, като поставяхме в продължение на 7 дни в храната на мишки ddY 5% сух прах от H. erinaceus. Установихме нарастване в нивото на mРНК експресирания NGF в хипокампа на мишките. Заключението ни е, че H. erinaceus съдържа активни съставки, които стимулират синтеза на NGF чрез активиране на JNK пътя; тези съединения не са хериценони.

Ключови думи: *неврорастежен фактор; *Hericium erinaceus; *астроцитом; *hericenone

Сенилната деменция е сериозен социален проблем. Това важи особено за болестта на Алцхаймер, за която понастоящем няма ефективна терапия и която е най-честата форма на сенилна деменция. В холинергичните неврони на базалния прозенцефалон на пациенти, страдащи от болестта на Алцхаймер, са установени значителни аномалии.1) Невротрофичните фактори притежават силни биологични действия като предотвратяване смъртта на невроните, промотиране растежа на невритите и поддържане и функционална организация на невроните.2) Глиалните клетки подкрепят невроните чрез освобождаване на невротрофични фактори, каквито са неврорастежният фактор (NGF), извлеченият от мозък невротрофичен фактор (BDNF), невротрофин 3 и извлеченият от глия невротрофичен фактор (GDNF). Предполага се, че има връзка между функционалния дефицит на NGF и болестта на Алцхаймер и че този дефицит играе роля в етиологичния процес на болестта.3)

Знае се, че нивата на NGF в базалния прозенцефалон на страдащите от болестта на Алцхаймер и във фронталната мозъчна кора на пациенти без деменция, но със сенилни плаки са понижени.4,5) Нещо повече, интрацеребровентрикуларното прилагане на NGF елиминира дегенерацията и когнитивния дефицит при плъхове с мозъчно увреждане6) и усилва запаметяването на пасивен авойдънс[2] при развиващи се мишки.7) При стари мишки интрацеребралната инфузия с NGF частично реверсира атрофията на холинергичните клетки и подобрява запазването на пространствената памет.8) Освен това, интраназалното прилагане на NGF намалява невродегенерацията и броя на амилоидните плаки в трансгенни anti-NGF мишки (AD11 мишки), имащи прогресиращ невродегенеративен фенотип, наподобяващ болестта на Алцхаймер.9) Ето защо се очаква NGF да се приложи за лечение на болестта на Алцхаймер.10)

Невротрофичните фактори обаче са протеини и като такива са неспособни да преминават през кръвно-мозъчната бариера. Освен това те лесно се метаболизират от пептидазите. Поради това се предполага, че използването им като лекарство за лечение на невродегенеративни нарушения ще срещне затруднения. Алтернативен подход е използван в проучвания върху съединения с ниско молекулно тегло, които да промотират биосинтеза на NGF, като катехоламини,11,12) бензоквинони,13) фелутамиди,14) идибенон,15) канзуинин, ингенол триацетат, жолкинолид B,16) диктиофорини,17) скабронини,18) хериценони,18—21) еринацини,22—24) и цирнеини.25)

Hericium erinaceus е гъба, която расте върху стари или мъртви широколистни дървета. H. erinaceus се употребява като храна в Япония и Китай, без вредни последици. Хериценоните C-h2,19–21) и еринацините A-I22—24) са изолирани от плодното тяло, респективно мицелите на H. erinaceus и всички те промотират синтезирането на NGF в култивирани астроцити на гризачи. Тези резултати говорят за полезността на H. erinaceus за лечение и превенция на деменцията. Но точният механизъм, по който H. erinaceus индуцира синтеза на NGF остава неизвестен.

В настоящето проучване, ние изследвахме етанолови екстракти от H. erinaceus за NGF-индуциращо действие върху човешки астроцитомни клетки 1321N1. Получените резултати показват, че екстрактът от H. erinaceus притежава NGF-индуциращо действие, но неговите активни съставки не са хериценони. Освен това, мишки ICR, в чиято храна се поставяше 5% сух прах от H. erinaceus в продължение на 7 дни, показаха повишаване на нивото на mРНК експресирания NGF в хипокампа.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Материали

Модифицираната Игъл среда на Дюлбеко (DMEM) доставихме от Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Japan). FCS беше от Biological industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel). HS беше от ICN Biochemicals, inc. (Costa Mesa, CA, U.S.A.). Tri Pure Isolation Reagent беше от Roche Di­agnostics (Іndianapolis, U.S.A.). Oligo (dT) primer и NGF ELІSA Kit Emax® Іmmunoassay System бяха доставени от Promega Co., Ltd. (Madison, Wi, U.S.A.). Rever Tra Ace беше от Toyobo Co., Ltd. (Tokyo, Japan). Syber Premix Ex Taq беше от Takara Bio inc. (Shiga, Japan). UО126 беше от Sigma Aldrich Japan (Tokyo, Japan). SP600125 беше от BiOMOL (Plymouth Meeting, PA, U.S.A.). A23187, SB203580 и GF109203X бяха от Calbiochem (San Diego, CA, U.S.A.). H89 беше от Seikagaku Corporation (Tokyo, Japan). Anti-NGF беше от Boehringer Mannheim (Mannheim, Ger­many). Anti-phospho-ERK (Thr202/Tyr204) antibody, Anti-ERK antibody, anti-phosho-JNK (Thr183/Tyr185) antibody, anti-JNK antibody, anti-phospho-c-Jun (Ser63) antibody, and anti-c-Jun antibody бяха получени от Cell Signaling Tech­nology (Beverly, MA, U.S.A.). Реакция PCR в реално време беше проведена при използване на Opticon real-time PCR system (Bio-Rad Labo­ratories inc., Japan). Декстринът беше от Wako Pure Chemical industries Ltd. (Tokyo, Japan). Мишките ddY бяха закупени от Japan SLC inc. (Shizuoka, Japan). Hericium erinaceus, Pleurotus eryngii, Grifola frondosa, и Agaricus blazei бяха култивирани от Hokuto Corporation в техните лаборатории (Nagano, Japan).

Клетъчна култура

Клетките 1321N1 бяха отглеждани в модифицираната Игъл среда на Дюлбеко (DMEM), към която бяха добавени 5% FCS, Penicillin (50 U/ml) и Streptomycin (50 μg/ml). Клетките PC-12 бяха отглеждани в DMEM, към която бяха добавени 10% FCS, Penicillin (50 U/ml) и Streptomycin (50 μg/ml). Клетките бяха култивирани при температура 37°C в инкубатор, съдържаш 5% CO2.

Приготвяне на гъбените екстракти

Пресни плодни тела от H. erinaceus, P. eryngii, G. frondosa и A. blazei бяха лиофилизирани и направени на прах. Сухият гъбен прах (5g) беше екстрахиран с 150 ml етанол за 2 часа на стайна температура. Така бяха получени 499 mg етанолов екстракт от H. erinaceus, 386 mg етанолов екстракт от P. eryngii, 328 mg етанолов екстракт от G. frondosa и 426 mg етанолов екстракт от A. blazei. Екстракцията на H. erinaceus бе извършена с H2О и етилов ацетат, при което бяха получени 1734 mg H2О екстракт от H. erinaceus и 257 mg етилацетатен екстракт от H. erinaceus. До употребата им екстрактите се съхраняваха на -30 °C.

RT-PCR

Клетки 1321N1 бяха посети в 12-кладенчови плаки и оставени да растат, за да конфлуират. Двадесет и четири часа преди да бъдат инкубирани клетките заедно с гъбените екстракти хранителната им среда бе заменена с несъдържаща серум среда DMEM. Гъбеният екстракт бе разтворен в DMSO в количество 50 mg на милилитър и разреден с несъдържаща серум среда DMEM до желаната концентрация. Клетките 1321N1 бяха инкубирани с гъбените екстракти в продължение на 3 часа. Общата РНК на клетките 1321N1 бе екстрахирана с помощта на Tri Pure Isolation Reagent съгласно протокола на производителя. От обща РНК (1 μg) бе получена чрез Rever Tra Ace едноверижна cДНК, която бе подложена на прайминг с Oligo (dT) праймер и разредена с вода петкратно, за да се използва като темплит за PCR анализ в реално време. Праймерите за амплификация и големините на съответните PCR продукти бяха следните: NGF (кодон: 5′-CCAAGGGAGCAGTTTCTATCCTGG-3′, и антикодон: 5′- GGCAGTTGTCAAGG GAATG CTGAAGTT-3′ за 189bp), b-actin (кодон: 5′-AGGGAAATCG TGC GT GACAT-3′, антикодон: 5 ‘-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′, за 467bp), c- fos (кодон:5′-GTTCTCGG GTTTC AACGCGGACTACGA-GGC-3’, антикодон: 5 ‘-GGCACTAGAGACGGACAGATCT- GCGCAA AAGTCC-3’, за 922bp). Реакцията „PCR в реално време” бе извършена в 20 μl разтвор, съдържащ SYBR Premix (10 μ), RT темплит (3 μl), вода (6 μl) и праймери (1 μl). Амплификационните програми бяха следните: NGF, 94 °C за 5 s, 61°C за 20 s и 72°C за 15 s, за 35 цикъла; b-actin, 94 °C за 10 s, 56 °C за 20 s и 72 °C за 30 s, за 22 цикъла; и c-fos, 94 °C за 10 s, 55°C за 30 s и 72°C за 60 s, за 39 цикъла. Нивата на NGF и c-fos mРНК бяха нормализирани до това на съответната β-actin mРНК.

Изпитване за растеж на невритите на клетки PC12

Клетки 1321N1 бяха посети в 24-кладенчови плаки и оставени да растат, за да конфлуират. Двадесет и четири часа преди инкубацията с екстракти от H. erinaceus или хериценон D средата бе заменена с несъдържаща серум среда DMEM. След инкубирането с екстракти от H. erinaceus или хериценон D в продължение на 48 часа, средата бе аспирирана и центрофугирана, за да се отделят от нея клетките.

Клетките PC-12 бяха посети в 24-кладенчови плаки в количество 7х104 клетки/кладенче и култивирани в продължение на 24часа. След аспириране на средата бяха добавени DMEM, съдържаща10% FCS и 5% HS (100 μl) и среда за култивиране на клетки 1321N1, приготвена както е описано по-горе (400 μl) с последващо инкубиране в продължение на 48 часа. Клетките PC-12 бяха стимулирани с екстракт от H. erinaceus или направо с NGF в продължение на 48 часа. След това клетките PC-12 бяха наблюдавани под фазово-контрастен микроскоп, при което растежът на неврита бе считан за белег на диференциация. Оценени бяха по около сто клетки PC-12 от всяко кладенче. Клетки, имащи неврити по-дълги от диаметъра им, бяха считани за диференцирани клетки. Данните за това са изразени като средни±S.E.M. от стойностите за три кладенчета.

Ензимен имуноанализ на NGF

Клетки 1321N1 бяха посети в 24-кладенчови плаки и оставени да растат, за да конфлуират. Двадесет и четири часа преди инкубацията с гъбените екстракти средата бе заменена с несъдържаща серум среда DMEM. Гъбеният екстракт бе разтворен в DMSО в количество 50 mg на милилитър и разреден несъдържаща серум среда DMEM до желаната концентрация. Клетки 1321N1 бяха инкубирани с гъбените екстракти в продължение на 24 часа, след което културелната среда бе отделена. Съдържанието на NGF в средата се измерваше чрез ELІSA (Emax® Immunoassay System, Promega) в съответствие с указанията на производителя с изключение на това, че се използваше anti-NGF вторично антитяло.

Имуноблот анализ

След инкубация средата се отстраняваше, а клетките се поставяха в лизиращ буфер (75mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% глицерол, 3% 2-меркаптоетанол и 0.003% бромфенол синьо) за 15 минути на стайна температура, след което се отделяха. Лизатите се подлагаха на SDS-PAGE[3] в 10% полиакриламиден гел. Сепарираните протеини се прехвърляха върху поливинилиден дифлуоридна мембрана (Millipore, Biller- ica, MA, U.S.A.), при което се използваше полусух блот апарат. Мембраната беше блокирана с 3% обезмаслено мляко в Tris-буфериран физиологичен разтвор с pH 7.4, съдържащ 0.1% Tween 20 (TBST) в продължение на 40 минути на стайна температура. Мембраната беше промивана с TBST и инкубирана заедно с първичните антитела в продължение на една нощ на 4°C. След това мембраната беше промивана с TBST и инкубирана в продължение на 2 часа на стайна температура с вторичните антитела, конюгирани с хрян-пероксидаза. Имунореактивните протеини бяха открити посредством ECL Western blotting detection system.

Изолиране и анализ на хериценони C, D и E

Пресни плодни тела на H. erinaceus (6.0 kg) бяха екстрахирани с етанол. Екстрактът беше концентриран и фракциониран чрез разделяне на разтворителя на хлороформ и вода. Хлороформната фракция (25.0 g) беше подложена на колонна хроматография със силициев гел при използване на толуол и ацетон в качеството на елуент[4]. Толуол-ацетон елуентът (9:1) бе подложен на колонна хроматография със силициев гел при използване на хексан-етилов ацетат. Хексан-етилово ацетатният (10:1) елуат беше по-нататък пречистен чрез ОDS колонна хроматография с метанол, при което се получиха 210.9 mg хериценон C, 35.4 mg хериценон D и 48.0 mg хериценон E. Техните спектрални данни (1H-NMR, 13C-NMR, ІR иHR-FAB-MS) са в пълно съответствие със съобщаваните.20

Хериценоните C, D и E в екстракта от H. erinaceus бяха анализирани посредством HPLC (Shimadzu LC-10 серии, SPD-6AV UV-VІS детектор Shimadzu, нагласен на 260 nm, с μbondapak C18 3.9X300 mm, 10 μm колона (Waters). Разтворителят, използван за сепариране беше ацетонитрил, а скоростта на потока 1.0 ml/min.

NGF mРНК експресия в мозъчна тъкан на мишки

Бяха използвани пет седмични мъжки мишки ddY с тегло в началото на експериментите 33-35 грама. Мишките бяха разделени на две групи с уеднаквено тегло – контролна група и група с H. erinaceus. На мишките от контролната група бе давана обикновената диета (MF, Oriental Yeast, Tokyo, Japan) съдържаща 5% декстрин, а на H. erinaceus – MF, съдържаща 5% замразен сух прах от H. erinaceus. Животните получаваха храна и вода без ограничения и живееха в контролирани условия при температура 24 ±1 °C, относителна влажност 45 ±5% и 12-часова светлина (09:00—21:00). Мишките получаваха експерименталната диета в продължение на 1 или 7 дни. В края на експеримента мишките бяха убивани чрез пречупване на шията и се изрязваха мозъчната кора и хипокампа. Тъканите бяха хомогенизирани веднага в Tri Pure Іsolation Reagent (Takara, Japan) и екстрахирани според указанията на производителя. След това се изследваше mРНК експресирания NGF с реакция RT-PCR.

Статистически методи

Получените данни са изразени като средни±S.E.M. Статистически значимите различия (p<0.05) са изразени чрез еднопосочна ANОVA, последвана от тест на Tukey.

РЕЗУЛТАТИ

Първо изследвахме NGF-индуциращото действие на четири ядливи гъби, H. erinaceus, P eryngii, G. frondosa и A. brazei в човешки астроцитомни клетки 1321N1. Нивото на mРНК експресиран NGF в клетки 1321N1се повиши значително от калциевия йонофор A23187 в концентрация 1 μM (позитивна контрола) и от етаноловия екстракт на H. erinaceus в концентрация 100 mg/ml. Етаноловите екстракти на другите гъби не индуцираха значително нарастване в нивата на mРНК експресирания NGF (Фиг.1). Освен това, етаноловият екстракт на H. erinaceus повишаваше нивото на протеина NGF в културелната среда, нещо което етаноловите екстракти от останалите три гъби не правеха (Фиг. 2). Нещо повече, ние изследвахме ефекта на водните и етилацетатните екстракти от H. erinaceus върху mРНК експресията на NGF и я сравнихме с ефекта от етаноловия екстракт. Установихме, че етаноловият и етилацетатният екстракт промотират mРНК експресията на NGF еднакво силно и по начин, зависещ от концентрацията им. Водният екстракт не засилваше mРНК експресията на NGF.

Ефекти на гъбените екстракти върху mРНК експресията на NGF в клетки 1321N1

Клетките 1321N1 бяха стимулирани с етанолови екстракти (100 μg/ml) от H. erinaceus (H), P eryngii (P), G. frondosa (G), A. blazei (A), и A23187 (1 μM като позитивна контрола) за 3 часа на 37°C, след което се изследва генната експресия на NGF посредством RT-PCR. Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). *p

Ефекти на гъбените екстракти върху секрецията на NGF от клетки 1321N1

Клетки 1321N1 бяха стимулирани с етанолов екстракт (50, 100, 150 μg/ml) от H. eri­naceus (H), етанолови екстракти (100 μg/ml) от P eryngii (P), G. frondosa (G), A. blazei (A) и A23187 (1 μм, като позитивна контрола) за 24 часа на 37°C. Количеството NGF протеин в културелната среда на клетките 1321N1 бе измерено чрез ELІSA. Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). *p

Ефекти на екстракта от H. erinaceus върху mРНК експресията на NGF в клетки 1321N1

Клетките 1321N1 бяха стимулирани с воден екстракт (0.4, 2.0, 4.0 mg/mlетанолов екстракт (50, 100, 150μ/ml) и етилацетатен екстракт (50, 100, 150 μg/ml) в продължение на 3 часа на 37°C, след което генната експресия на NGF беше изследвана с RT-PCR. Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). *p

Ефекти на хериценоните C, D и E върху mРНК експресията на NGF в клетки 1321N1.

Клетките 1321N1 бяха стимулирани с хериценони C, D и E (10, 30, 100 μg/ml) в продължение на 3 часа на 37°C, след което генната експресия на NGF беше изследвана с RT-PCR. Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). *p

Морфологична диференциация на клетки PC 12, индуцирана от хранителната среда на клетките 1321N1, кондиционирана с етанолов екстракт на H. erinaceus

(A) Морфологични промени на клетки PC12. Клетки PC12 бяха директно стимулирани с етанолов екстракт (100 μg/ml) на H. erinaceus (H) или NGF (100 ng/ml) в продължение на два дни (горните фигури). Клетки PC12 бяха стимулирани в продължение на два дни с 20% DMEM плюс 80% културелна среда на 1321N1, кондиционирана с 125 или 250 μg/ml етанолов екстракт на H. erinaceus (долните фигури). Линеен мащаб: 100 μm. (B) Оценка на растежа на неврита. Клетки PC12 бяха директно стимулирани с етанолов екстракт (100 μg /ml) от H. erinaceus (H) или NGF (0.1-100ng/ml) в продължение на два дни (ляво). След като клетки 1321N1 бяха инкубирани в продължение на два дни в DMEM, съдържаща 125 или 250 μg/ml етанолов екстракт от H. erinaceus (H) или 30 μg/ml хериценон D (He.D), клетките PC12 бяха култивирани за още два дни в 20% DMEM плюс 80% 1321N1 културелна среда (дясно). Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). *, †< 0.05.

След това, изпитахме индуциращата активност на C, D и E хериценоните върху mРНК експресирания NGF. За тези компоненти на H. erinaceus се съобщава, че в концентрация 33 μg/ml са стимулирали биосинтеза на NGF в астроглиални клетки.20) Ние не наблюдавахме повишаване на mРНК експресирания NGF в клетки 1321N1 при концентрации 10-100 μg/ml на хериценоните C, D и E (Фиг. 4). Нещо повече, ние не успяхме да демонстрираме стимулиращ ефект на хериценоните C, D и E върху mРНК експресията на NGF в първична култура от астроглиални клетки на плъх (данните не са показани). Освен това, анализирахме посредством HPLC[5] нивата на хериценоните C, D и E в етаноловите екстракти на H. erinaceus. Установихме следните концентрации в 100 μg/ml етанолов екстракт на H. erinaceus: 20 ng/ml за хериценон C, 4 ng/ml за хериценон D и 2 ng/ml за хериценон E.

За да изучим физиологичните ефекти на H. erinaceus върху растежа на невритите, осъществяван чрез NGF, ние култивирахме в продължение на два дни клетки PC-12 в кондиционирана среда на клетки 1321N1, инкубирани за 24 часа в етанолов екстракт на H. erinaceus. Това, че NGF промотира значително растежа на невритите на клетките в концентрации 10 и 100 ng/ml, но не и в концентрации 0.1 и 1 ng/ml, означава, че нивото на NGF в кондиционираната с екстракт на H. erinaceus среда на клетките 1321N1 (Фиг. 2) е било твърде ниско, за да промотира растежа на невритите на клетките PC-12. Нещо повече, етаноловият екстракт на H. erinaceus не промотира директно растежа на невритите на клетките PC12. Растежът на невритите обаче бе значително промотиран от кондиционираната с етанолов екстракт на H. erinaceus среда на клетките1321N1 в концентрации 125 или 250 μg/ml, инкубирани за 24 часа. От друга страна, хериценон D не показа ефект, сходен на етаноловия екстракт на H. erinaceus (Фиг. 5).

За да изясним механизма, стоящ в основите на индукцията на NGF от H. erinaceus, клетки 1321N1 бяха третирани с различни киназа инхибитори преди стимулирането им с етанолов екстракт на

H. erinaceus. Промотирането на mРНК експресирания NGF от етаноловия екстракт на H. erinaceus беше значително инхибирано от c-Jun N-терминалния киназен (JNK) инхибитор SP600125, но не и от MEK инхибитора U0126, р38 MAPK инхибитора SB203580, PKA инхибитора H89 или PKC инхибитора GF109203X (Фиг. 6). В действителност, етаноловият екстракт на H. erinaceus индуцира фосфорилиране на JNK и произхождащия от него субстрат c-Jun по начин, зависещ от времето (Фиг. 7). Нещо повече, етаноловият екстракт усилва експресията на гена c-fos (Фиг. 8).

За да изследваме ефекта на H. erinaceus in vivo, ние измерихме mРНК експресията на NGF в мозъчната кора и хипокампа на мишки, на които е приложен H. erinaceus. В продължение на 1 или 7 дни в храната на мишките от групата с H. erinaceus бе добавян 5% сух прах от H. erinaceus, а в тази на мишките от контролната група 5% декстрин. На седмия ден нивото на експресирания от mРНК NGF в хипокампа на мишките от групата с H. erinaceus бе значително по-високо от това в контролната група. От друга страна, по време на тест периода не се наблюдаваше повишаване на нивото на mРНК експресирания в кората NGF (Фиг. 9).

Ефекти на U0126, SP600125, SB203580, H89 и GF109203X върху индуцираната от H. erinaceus mРНК експресия на NGF
Клетки 1321N1 бяха предварително инкубирани с U0126 (10 μм), SP600125 (30 μм), SB203580 (3 μм), H89 (10 μм) и GF109203X (5 μм) в продължение на 20 минути преди добавянето на екстракт от H. eri­naceus. След инкубация с етанолов екстракт от H. erinaceus (100 μg/ml) в продължение на 3 часа, mРНК експресираният NGF бе изследван чрез RT-PCR. Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). *, †p< 0.05.

Индуцирано от H. erinaceus фосфорилиране на JNK и c-Jun в клетки 1321N1
Клетки 1321N1 бяха инкубирани с етанолов екстракт от H. erinaceus (100 μg/ml) за определено време, след което фосфорилирането на JNK и c-Jun бе анализирано посредством Western blotting. (A) Зависещо от времето нарастване в нивото на фосфорилиране на JNK, индуцирано от H. erinaceus. (B) Зависещо от времето нарастване в нивото на фосфорилиране на c-Jun, индуцирано от H. erinaceus.

ОБСЪЖДАНЕ

В това проучване ние демонстрирахме, че етаноловият екстракт на H. erinaceus промотира синтеза на NGF в човешки астроцитомни клетки 1321N1. Единствено H. erinaceus от четирите изследвани гъби индуцираше NGF. Етаноловият екстракт на H. erinaceus в концентрация 100 μg/ml обаче повишаваше значително mРНК експресията на NGF, но не и протеиновата синтеза на NGF. Ето защо е възможно ефективните концентрации на етаноловия екстракт от H. erinaceus да индуцират протеинов синтез на NGF, като секрецията е различна от тази, индуцирана от mРНК експресирания NGF, тъй като протеиновият синтез/секреция се регулира от няколко фактора.

Ефекти на етанолови екстракти от H. erinaceus върху c-fos mРНК експресията в клетки 1321N1.
Клетки 321N1 бяха стимулирани с етанолов екстракт от H. erinaceus (100 μg/ml) в продължение на 3 часа на 37 °C , след което посредством RT-PCR беше изследвана c-fos генната експресия. Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). *p< 0.05. vs. 0 минути.

NGF генна експресия в мозък на мишки, хранени с H. erinaceus
Храната на мишките съдържаше 5% H. erinaceus или декстрин (контрола). mРНК експресираният NGF в техния хипокамп и мозъчната кора беше определян посредством RT-PCR. Стойностите са представени като средни±S.E.M. (n=3). (ден 1 и ден 7: n=8; ден 21: n=3). * р

Морфологичната диференциация на клетките PC12 бе промотирана от кондиционираната среда на клетки 1321N1, инкубирани с етанолов екстракт от H. erinaceus, което показва, че H. erinaceus стимулира диференциацията на невроните чрез увеличено освобождаване на невротропни фактори включително NGF от глиалните клетки. Концентрацията на NGF, повишена от екстракта от H. erinaceus обаче изглежда твърде ниска, за да промотира растеж на невритите на клетките PC-12. Следователно, в растежа на невритите участват други фактори. Известно е, че астроцитите секретират други невротрофини, цитокини и растежни фактори, някои от които оказват влияние върху морфологичните промени или улесняват NGF-индуцираната диференциация на клетките PC12.26–28)

Съобщава се, че форболовите естери усилват PKC-зависимата синтеза на NGF в първични миши астроцити, а за AP-1, една от мишените на PKC, се смята, че регулира генната експресия на NGF.29) В действителност, съществува AP-1 консенсусна последователност (TRE: TPA-отговор), произхождаща от TATA бокса на мястото на съединяване на екзон I/интрон I региона в гена на NGF.30) AP-1 се състои от хомо- или хетеро димери на Jun/Jun или Fos/Jun, които се свързват с ДНК на сайта TRE на AP-1. В настоящето проучване, усилването на генната експресия на NGF от H. erinaceus беше инхибирано от JNK инхибитора SP600125, а H. erinaceus предизвикваше фосфорилиране на JNK. Тези резултати показват, че JNK участва в усилването на генната експресия на NGF, индуцирана от H. erinaceus. JNK е преобладаващата киназа във фосфорилирането на c-Jun.31) Нещо повече, H. erinaceus усилва c-Jun фосфорилирането и експресията на гена на c-fos, както и фосфорилирането на JNK. Приема се, че активирането на AP-1 от H. erinaceus има отношение към генната експресия на NGF, но PKC не участва в сигнализирането поради липсата на инхибиращо въздействие от PKC инхибитора GF109203X.

Съобщава се, че активните компоненти на H. eri­naceus са хериценоните C-H, които стимулират протеиновата синтеза на NGF в астроцитите на мишки или плъхове.19—21) Но хериценоните C, D и E не показаха никаква промотираща активност по отношение на NGF в условията на настоящия експеримент, при който използвахме човешки астроцитомни клетки 1321N1. Освен това, концентрацията на хериценоните беше твърде ниска (концентрацията на хериценони C, D и E в 100 μg/ml етанолов екстракт от H. erinaceus бяха съответно 20, 4 и 2 ng/ml) в сравнение с ефективната им концентрация (33 μg/ml), както бе показано в предишно съобщение.20) Тези резултати говорят за възможността H. erinaceus да има други неизвестни активни съставки, които промотират експресията и са мастно разтворими (разтворими в етанол и/или етилов ацетат).

Нещо повече, оралното приложение на H. erinaceus повишаваше mРНК експресията на NGF в хипокампа на мишки. Този резултат води до предположението, че е възможно активното съединение да се абсорбира в кръвта и да попада в централната нервна система, преминавайки през кръвно-мозъчната бариера. Счита се, че хипокампът кодира работната памет.32) Повишаването на нивото на mРНК експресирания NGF в хипокампа говори за потенциала на H. erinaceus да въздейства in vivo върху централната нервна система. Но ние не можахме да открием, защо H. erinaceus повишава mРНК експресирания NGF в хипокампа, но не и в мозъчната кора. Това различие може да се дължи на вариации в нивото на експресия на сигнализиращите молекули, свързани с JNK сигнализиращия път или на кинетично различие в активните компоненти на H. erinaceus като разпределение в мозъка и метаболизма в мозъчните тъкани.

От друга страна е известно, че мицелите на H. erinaceus съдържат еринацини, които също стимулират синтеза на NGF.22–24) Съобщава се, че оралното приложение на еринацин А повишава значително нивото на NGF в локус церулеус и хипокампа на плъхове, но не и в мозъчната кора.33) Все още обаче няма съобщения за откриване на еринацини в плодното тяло на H. erinaceus. Така че е необходимо да се направи преоценка, дали плодните тела на H. erinaceus съдържат еринацини и да се потърсят в тях неизвестни деривати, имащи индуциращо въздействие по отношение на NGF.

В заключение, H. erinaceus съдържа активни съединения, които стимулират синтеза на NGF чрез активиране на JNK пътя; тези съединения не са хериценони.

Благодарности Това проучване беше отчасти подкрепено Grant-in-Aid for Scientific Research от Japan Society for Promotion of Science (No. 18790039 за Y. O. and No. 19659011 за N. N.), от Министерството на образованието, културата, спортовете, науката и технологиите (No. 18058002 заN. N.) на Япония и от фондацията „Hokuto Life Science”.

Koichiro MoRi,a,c Yutaro Obara/’4 Mitsuru Hirota/ Yoshihito Azumi,c Satomi Kinugasa,c Satoshi Inatomi,c and Norimichi NAKAHATA[1],a,b

a Department of Cellular Signaling, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Tohoku University; b 21st Century COE Program “CRESCENDO”, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Tohoku University; Aoba 6-3, Aramaki, Aoba- ku, Sendai 980-8578, Japan: c Mushroom Laboratory, Hokuto Corporation; 800-8 Shimokomazawa, Nagano 381-0008, Japan: and dDepartment of Bioscience and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shinshu University; 8304 Minami- minowa, Kami-ina, Nagano 399-4598, Japan.

ЛИТЕРАТУРА

1) Collerton D., Neuroscience, 19, 1-28 (1986).

2) Obara Y., Nakahata N., Drug News Perspect., 15, 290-298 (2002).

3) Allen S. J., Dawbarn D., Clin. Sci. (London), 110, 175-191 (2006).

4) Mufson E. J., Kroin J. S., Sendera T. J., Sobreviela T., Prog. Neurobiol., 57, 451-484 (1999).

5) Hellweg R., Gericke C. A., Jendroska K., Hartung H. D., Cervos- Navarro J., Int. J. Dev. Neurosci., 16, 787-794 (1998).

6) Kromer L. F., Science, 235, 214-216 (1987).

7) Ricceri L., Alleva E., Chiarotti F., Calamandrei G., Brain Res. Bull., 39, 219-226 (1996).

8) Fischer W., Wictorin K., Bjorklund A., Williams L. R., Varon S., Gage F. H., Nature (London), 329, 65-68 (1987).

9) Capsoni S., Giannotta S., Cattaneo A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 12432-12437 (2002).

10) Takei N., Tsukui H., Hatanaka H., J. Neurochem., 53, 1405-1410 (1989).

11) Furukawa Y., Furukawa S., Ikeda F., Satoyoshi E., Hayashi K., FEBS Lett., 208, 258-262 (1986).

12) Furukawa Y., Furukawa S., Satoyoshi E., Hayashi K., J. Biol. Chem., 261, 6039-6047 (1986).

13) Takeuchi R., Murase K., Furukawa Y., Furukawa S., Hayashi K., FEBS Lett., 261, 63-66 (1990).

14) Yamaguchi K., Tsuji T., Wakuri S., Yazawa K., Kondo K., Shigemori H., Kobayashi J., Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 195-199 (1993).

15) Nitta A., Hasegawa T., Nabeshima T., Neurosci. Lett., 163, 219-222 (1993).

16) Yamaguchi K., Uemura D., Tsuji T., Kondo K., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1749-1751 (1994).

17) Kawagishi H., Ishiyama D., Mori H., Sakamoto H., Ishiguro Y., Fu­rukawa S., Li J. D., Phytochemistry, 45, 1203-1205 (1997).

18) Obara Y., Nakahata N., Kita T., Takaya Y., Kobayashi H., Hosoi S., Ki- uchi F., Ohta T., Oshima Y., Ohizumi Y. D., Eur. J. Pharmacol., 370, 79-84 (1999).

19) Kawagishi H., Ando M., Mizuno T., Tetrahedron Lett., 31, 373-376 (1990).

20) Kawagishi H., Ando M., Sakamoto H., Yoshida S., Ojima F., Ishiguro Y., Ukai N., Furukawa S., Tetrahedron Lett., 32, 4561-4564 (1991).

21) Kawagishi K., Ando M., Shinba K., Sakamoto H., Yoshida S., Ojima F., Ishiguro Y., Ukai N., Furukawa S., Phytochemistry, 32, 175—178 (1993).

22) Kawagishi H., Shimada A., Hosokawa S., Mori H., Sakamoto H., Ishiguro Y., Sakemi S., J B., Kojima N., Furukawa S., Tetrahedron Lett., 37, 7399-7402 (1996).

23) Kawagishi H., Shimada A., Shirai R., Okamoto K., Ojima F., Sakamoto H., Ishiguro Y., Furukawa S., Tetrahedron Lett., 35, 1569-1572 (1994).

24) Lee E. W., Shizuki K., Hosokawa S., Suzuki M., Suganuma H., In- akuma T., Li J., Ohnishi-Kameyama M., Nagata T., Furukawa S., Kawagishi H., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2402-2405 (2000).

25) Marcotullio M. C., Pagiotti R., Maltese F., Oball-Mond Mwankie G. N., Hoshino T., Obara Y., Nakahata N., Bioorg. Med. Chem., 15, 2878-2882 (2007).

26) Althaus H. H., Richter-Landsberg C., Int. Rev. Cytol., 197, 203-277 (2000).

27) Cho S. G., Yi S. Y., Yoo Y. S., Neurosci. Lett., 378, 49-54 (2005).

28) Wu Y. Y., Bradshaw R. A., J. Biol. Chem., 271, 13033-13039 (1996).

29) Jehan F., Neveu I., Naveilhan P., Wion D., Brachet P., Brain Res., 672, 128-136 (1995).

30) Hengerer B., Lindholm D., Heumann R., Ruther U., Wagner E. F., Thoenen H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3899-3903 (1990).

31) Minden A., Lin A., Claret F. X., Abo A., Karin M., Cell, 81, 1147-1157 (1995).

32) White N. M., McDonald R. J., Neurobiol. Learn. Mem., 77, 125-184 (2002).

33) Shimbo M., Kawagishi H., Yokogoshi H., Nutr. Res., 25, 617-623 (2005).

[1] С кого можете да кореспондирате . e-mail: nakahata@mail.pharm.tohoku.ac.jp
[2] Липса на отговор, когато отговорът се наказва (бел.пр.)
[3] sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (бел.пр.)
[4] Елуент – в хроматографията, разтворител, използван за сепариране на материали
[5] Съкратено от High-performance liquid chromatography (високоефективна течна хроматография) (бел.пр.)