Активността на клетките естествени „убийци” и качеството на живот на пациентки с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия, се подобри чрез консумиране на екстракт от гъбата Agaricus blazei Murill Kyowa

(Natural killer cell activity and quality of life were improved by consumption of a mushroom extract, Agaricus blazei Murill Kyowa, in gynecological cancer patients undergoing chemotherapy)

Резюме
Ahn W-S, Kim D-J, Chae G-T, Lee J-M, Вае S-M, Sin R Kim Y-W, Namkoong S-E, Lee IP. Natural killer cell activity and quality of life were improved by consumption of a mushroom extract, Agaricus blazei Murill Kyowa, in gynecological cancer patients undergoing chemotherapy. Int. J Gynecol Cancer 2004;14:589-594

Има съобщения, че гъбата Agaricus blazei Murill Kyowa (ABMK) притежава антимутагенни и антитуморни ефекти. Тук ние представяме проучването си за благотворните ефекти от консумирането на ABMK върху имунологичния статус и качеството на живот на пациентки с рак, провеждащи химиотерапия. Сто пациентки с рак на маточната шийка, яйчниците и ендометриума бяха третирани с carboplatin (300mg/m²) плюс VP16 (etoposide, 100mg/m ²) или с carboplatin (300mg/m²) плюс taxol (175mg/m²) на всеки 3 седмици в продължение на поне три цикъла със или без приемане на ABMK през устата. Ние установихме, че активността на клетките естествени „убийци” е статистически значимо по-висока в групата, третирана с
ABMK (ANOVA, n = 39, P < 0.002) в сравнение с не третираната плацебо група (n = 61). Не се наблюдаваше статистически значима разлика обаче в лимфокин активираните „убийци” и активността на моноцитите по начин подобен на разликата в популациите на отделните имунни клетки в третираната с ABMK и нетретираната групи. Всички странични ефекти, свързани с химиотерапията като безапетитие, алопеция, емоционална нестабилност и обща слабост намаляха в резултат на третирането с ABMK. Всичко това показва, че третирането с ABMK може да е от полза за пациентките с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия.

КЛЮЧОВИ ДУМИ: алтернативна терапия, Agaricus blazei Murill Kyowa, гинекологичен рак, качество на живот.

Адрес за кореспонденция и получаване на отпечатъци: Dr Woong-Shick Aim, Ml?, PhD, Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, “1Ъе Catholic University of Korea, 505 Banpo-Dong, Seocho-Ku, Seoul 137-040, South Korea. Email: ahmvs@catholic.ac.kr

Гинекологичният рак е важна причина за смърт при жените по целия свят. Ракът на маточната шийка по-специално се причинява предимно от инфекция с високо рисковата група на човешките папилома вируси (HPV)^(1-3). Два HPV онкогенни протеина, E6 и E7, играят критична роля в индуцирането на цервикалния рак взаимодействайки си с p53 и pRB за инактивирането на тези клетъчни регулаторни протеини ^(4-5). Мултимодалната химиотерапия е един от терапевтичните подходи, използвани при пациентките с рак на маточната шийка. Овариалният рак е също много смъртоносна болест. Поради безсимптомното протичане на ранния им стадий повечето случаи на рак на яйчниците се диагностицират в напреднал стадий. Това определя лошата прогноза на овариалния рак. Въпреки големия прогрес в лечението на пациентките с гинекологичен рак през последните тридесет години, рецидивиращият и персистиращият рак остават проблематични. Химиотерапията е постигнала голям напредък в лечението на болните от рак. Но химиотерапевтичните агенти предизвикват тежки и животозастрашаващи странични ефекти, каквито са тежката имуносупресия и потискането на костния мозък, които правят още по-важно разработване на средства за намаляване на страничните ефекти от химиотерапията.

За екстракта от гъбата, Agaricus blazei Murill Kyowa (ABMK) има съобщения, че проявява антимутагенен ефект⁽⁶⁾. Освен това се съобщава, че ABMK има и туморициден и имунопотенциращ ефект^(7-11). В едно проучване интратуморното инжектиране на екстракт от A. blazei е имало за резултат инфилтриране с клетки естествени „убийци” (NK) на тези места в тумора и повишена активност на NK клетките в опитните животни ^(7,12). Антитуморните свойства на екстракта се отдават на неговия основен компонент, p-глюкана ^(7,8,10,11). Понастоящем, ABMK се консумира като храна или чай по целия свят, което е свързано с очакваните от него медицински ефекти.

Целта на това проучване бе да оценим, дали консумацията на ABMK може да има някакъв благоприятен ефект при пациенти с гинекологичен рак, лекувани химиотерапевтично от отделението по акушерство и гинекология на нашата клиника „St Mary” в Kangnam с carboplatin (300mg/m²) плюс VP16 (etoposide, 100mg/m²) или carboplatin (300mg/m²) плюс taxol (175 mg/m²). Установихме, че ABMK оказа известен позитивен ефект на присъщата на NK клетките активност и общо на качеството на живот на пациентките, провеждащи химиотерапия. Това клинично наблюдение показва, че консумацията на ABMK може да бъде полезна за поддържане на имунната активност и качеството на живот на пациентките с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия.

Материали и методи

Кохорти

В това проучване бяха включени сто гинекологични пациентки, които посетиха отделението по акушерство и гинекология на клиника „St Mary” в Kangnam (Сеул, Южна Корея) през 3-годишния период от 1999г. до 2001г. Пациентките бяха разделени на случаен принцип и „на сляпо” на две групи за третиране с ABMK и плацебо. Подробности за пациентките са дадени на Таблица 1.

Терапевтичен режим

Пациентките бяха третирани с carboplatin (300mg/ m²) плюс VP16 (etoposide, 100mg/m²) или carboplatin (300mg/ m²) плюс taxol (175mg/m²) в продължение на поне три цикъла със или без ежедневна консумация на ABMK (три пакетчета /ден, по едно на прием, получени от Kyowa Engineering Co., Tokyo, Japan). Вземаше им се кръв един ден преди първата и един ден след втората химиотерапия. Тестваните пациентки получаваха първата си терапия. Анализираха се активността на NK клетките и лимфокин-активираните клетки „убийци” (LAK), броят на белите кръвни клетки (WBC), лимфоцитите, моноцитите, CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺ , CD48⁺ и CD56⁺ клетките, както и нивото на продуциране на H₂O₂ от моноцитите.

Брой на имунните клетки

Броенето на белите кръвни клетки, лимфоцитите и моноцитите се извършваше с уреда XE-2100 (Sysmex, Kobe, Japan). Броят на CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD48⁺ и CD56⁺ клетките беше анализиран чрез флуоресцентно активиран клетъчно сортировъчен (FACS) анализ. Маркирани с флуоресцин изотиоцианат (FITC) моноклонални антитела, специфични за човешките CD3, CD4, CD8, CD48 и CD56 клетки бяха доставяни от DiNona (Seoul, South Korea), Immunotech (Westbrook, ME) или Beckman Coulter (Fullerton, CA).

Изолиране на периферни кръвни мононуклеарни клетки от кръв

Периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMC) получихме чрез центрофугиране през плътностни градиенти –Ficoll на левкоцитни „buffy coats”¹, които на свой ред бяха получени от пациентки в болницата „St. Mary” в Kangnam. Мононуклеарните клетки бяха промити двукратно с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, който бе използван и за по-нататъшно пречистване на избрани клетъчни популации.

Анализ на цитотоксичността на NK и LAK клетките

Активност на клетки естествени „убийци” (NK), лимфокин-активирани „убийци” (LAK), и моноцити на пациентки, провеждащи химиотерапия със и без третиране с Agaricus blazei Murill Kyowa (ABMK). Пациентките с гинекологичен рак бяха третирани с carboplatin (300mg/m²) плюс VP16 (100mg/m²) или carboplatin (300mg/m²) плюс taxol (175mg/m²) на седмици 0, 3 и 6. ABMK бе прилаган орално всеки ден (три пакетчета/ден). Един ден преди всяка химиотерапия бе вземана кръв за изследване и се тестваха имунните клетки, както е посочено в „Материали и методи”. RFU, relative fluorescence unit. *Статистически значимо при P<0.05 (по „anova”) в сравнение с групата, третирана с плацебо.

NK клетките бяха прочистени от PBMC чрез CD56 microbead²

(Miltenyi Biotec, GmBH, Bergisch Glad bach, Germany) в съответствие с указанията на производителя. FACS³ анализът на пречистените NK клетки показа чистота над 95%. По-нататък NK клетките бяха оставени да реагират с таргетните клетки K562 в съотношение 20:1 за 4часа на 37°C. При проучвания върху активността на LAK клетките, пречистените NK клетки първо се стимулират с рекомбинантен човешки интерлевкин-2 (IL-2) (Sigma, St. Louis, MO) в концентрация 400U/ml за 24часа. LAK клетките бяха оставени след това да реагират с таргетните клетки (по Daudi) в съотношение 3:1 за 3 часа на 37°C. След инкубацията клетъчният супернатант бе събиран и оценяван чрез използване на набор за откриване на цитотоксичност (BM, Manheim, Germany) в съответствие с указанията на производителя. След това за определяне на активността на лактат дехидрогеназата се определяше оптичната плътност на 490/630nm и цитотоксичността се изчисляваше така:

H₂O₂ анализ на моноцитите

Моноцитите се пречистваха от PBMC чрез използване на CD14 microbeads (Miltenyi Biotec) съгласно указанията на производителя. FACS анализът на пречистените моноцити показа над 95% чистота. След това моноцитите се поставяха в разреден 50 пъти разтвор на 2’,7‘- дихлорофлуоресцеин диацетат (10 μg/ml) и инкубираха на 37°C в продължение на 1 час. След инкубирането продуцираните нива на H₂О₂ бяха оценявани чрез измерване на оптичната гъстота при дължина на вълната 485/535 nm с Cytofluorometer (Millipore, Bedford, MA) и отразявани като релативни флуоресцентни единици.

Въпросници

След приключване на третирането с ABMK всички участници попълваха въпросник с данни за физическото и емоционалното им състояние: безсъние, апетит, алопеция, телесно тегло, гадене/повръщане, емоции, дискомфорт и обща телесна сила. Въпросникът, използван в проучването представляваше модификация на QLQ-30 Scoring Manual (2-ро издание) на EORTC (Европейската организация за проучвания и третиране на рака). Всички въпроси бяха разделени на две с възможност за три отговора (физически статус: по-добре, по-зле, без промяна; емоционален статус: безполезен, полезен, много полезен). Всички отговори бяха изразени в проценти.

Резултати

Броят на клетките или процентът на белите кръвни клетки (WBC) (A), лимфоцитите (B), моноцитите (C), и специфичната клетъчна популация (D-11) при пациентки, провеждащи химиотерапия със или без третиране с Agaricus blazei Minijl Kyowa (ABMK) . Пациентките с гинекологичен рак бяха третирани с carboplatin (300mg/m²) плюс VP16 (100mg/m²) или carboplatin (300mg/m²) плюс taxol (175mg/m²) на седмици 0, 3 и 6. ABMK бе прилаган орално всеки ден (три пакетчета/ден). Един ден преди всяка химиотерапия на пациентките бе вземана кръв за изследване и се тестваха имунните клетки , както е посочено в „Материали и методи”.

Пациентките с гинекологичен рак бяха разделени на две групи по двойно слепия метод. Тези пациентки получаваха венозно carboplatin плюс VP16 или carboplatin плюс taxol. Едната група получаваше ABMK, а другата – плацебо. На участничките в проучването се вземаше кръв за оценка на клетъчната активност на NK. Както е показано на Фигура 1, цитотоксичната активност на NK клетките беше статистически значимо по-висока (ANOVA, P < 0.002) в групата, третирана с ABMK (n = 39) в продължение на периоди от по 3 и 6 седмици в сравнение с контролната група, получавала плацебо (n = 61). Не бе установена никаква разлика в активността на NK клетките преди започване на третирането с ABMK. Това показва, че консумирането на ABMK може би е подпомогнало поддържането на цитотоксичната активност на NK клетките у пациентките с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия. Не бе наблюдавана статистически значима разлика в цитотоксичната активност на LAK клетките между групата с плацебо и групата, третирана с ABMK.

Ние тествахме още активността на моноцитите при пациентките с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия преди започване на третирането с ABMK. Оценихме нивата на продуциране на H₂О₂ от моноцитите като индикатор за тяхната активност. Както е показано на Фигура 1, нивата на продуциране на H₂О₂останаха непроменени през различните периоди на химиотерапията (седмици 0, 3 и 6) със или без прием на ABMK. Нещо повече, не бе наблюдавана статистически значима разлика в активността на моноцитите при пациентките в плацебо групата и групата с ABMK.

За да установим, дали консумацията на ABMK влияе върху популациите на имунните клетки при пациенти, провеждащи химиотерапия, ние определихме броя на определени имунни клетки като WBC, лимфоцитите, моноцитите, CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD48⁺ и CD56⁺ клетките. Както е показано на Фигура 2A при химиотерапията се наблюдава намаляване в броя на WBC. Но след консумация на ABMK не се открива нарастване на броя им. Нещо повече, не се наблюдава статистически значима разлика между броя на лимфоцитите, моноцитите, Т клетките, CD48⁺ и CD56⁺ клетките на пациентките с рак от плацебо групата и групата, получавала ABMK. (Фиг. 2B-H).

Evaluation of qualities of life in patients undergoing chemotherapy with and without Agaricus blazei MuriU Kyowa (ABMK) treatment. Gynecological cancer patients were treated with either carboplatin (300mg/m²) plus VP16 (100mg/m²) or carboplatin (300mg/m’) plus taxol (175ing/m²) at 0, 3, and 6 weeks. ABMK was orally administered even,’ day (three packs/day). At the time of completion of treatment, the patients were asked to fill out questionnaires to evaluate their own physical and mental conditions, improved; ffi, worsened; □, no change.

Чрез въпросниците ние оценихме физическото и емоционалното състояние на пациентките, провеждащи химиотерапия със или без консумация на ABMK. В това проучване ние се съсредоточихме само върху ползата от третирането с ABMK в сравнение с третирането с плацебо при пациентки на химиотерапия. Събрахме данни за състояния като безсъние, апетит, алопеция, телесно тегло, гадене/повръщане, емоции, дискомфорт и обща телесна сила. Както е показано на Фигура 3, тези физически и душевни състояния и особено апетитът, алопецията, гаденето/повръщането, емоционалното състояние и общата телесна сила са се подобрили значително в групата с консумация на ABMK в сравнение с групата с консумация на плацебо, което говори за позитивен ефект от консумацията на ABMK върху общото състояние на пациентите.

Обсъждане

Проучвания върху много експериментални животински модели са показали, че различни естествени фунгални продукти имат антитуморно действие ^(13–15). По-специално, при интратуморно инжектиране или орално приложение на екстракти от A. blazei е наблюдавана туморна регресия ⁽¹⁶⁾. В същото проучване антитуморната ефикасност се подобрила особено, когато екстракти от A. blazei са били третирани с киселини, което подсказва, че химическото състояние на екстрактите на A. blazei е от значение. Ние наблюдавахме при нашата група от пациентки с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия, по-значителни нива на активност на NK клетките при орално приложение на ABMK. Това показва, че ABMK може да оказва положително въздействие върху естествения имунитет на пациентките с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия. Това съответства на съобщенията, че инжектирането на тумори с екстракти от A. blazei води до по-голямо инфилтриране с NK клетки на инжекционните места ^(7,12) . Клетките NK играят важна роля в естествения имунитет, разпознавайки таргетните клетки (мишените) от главния клас І на тъканна съвместимост – негативните таргетни клетки, които могат да избегнат имунния надзор, упражняван от цитотоксичните Т клетки. NK клетките оказват драматичен ефект за редуцирането на туморната големина, както и за инхибиране метастатичните тумори ⁽¹⁷⁾. Механизмите за контролиране на цитотоксичността на NK клетките постепенно се изясняват, но все още разбирането им е частично. Освен това, за да насочват лизирането на таргетните клетки, NK клетките излъчват CD16, което им позволява да участват в антитяло-зависимата клетъчна цитотоксичност на обвитите с имуноглобулини туморни клетки. Съобщава се също, че директното интратуморно инжектиране на ABMK може да индуцира апоптоза и прекратяване на клетъчния цикъл на туморните клетки ⁽¹²⁾. Въз основа на всичко това, можем да направим извода, че ABMK изглежда полезен за раково болните. Подобно на това, екстрактите от A. blazei Murill могат да стимулират макрофагите и да индуцират секреция на тумор некротизиращия фактор-α, IL-8 и азотен окис^{(18 )}. Това наблюдение е в подкрепа на възможните ползи от ABMK. Ние проучихме също, дали консумацията на ABMK може да повлияе на общото физическо и душевно състояние на пациентките с гинекологичен рак, провеждащи химиотерапия. Установихме, че консумацията на ABMK намалява някои от страничните ефекти на химиотерапията. Подобрение имаше при безсънието, апетита, алопецията, телесното тегло, гаденето/повръщането, емоциите, дискомфорта и общата телесна сила, което показва, че консумацията на ABMK може да е ефективен подход за редуциране на някои от страничните ефекти на химиотерапията. Изказват се подозрения за възможно взаимодействие между химиотерапевтичните средства и ABMK и намаляване ефикасността на химиотерапията. Това не е вероятно при положение, че химиотерапевтичните лекарства се прилагат венозно, а ABMK орално. Въпреки това са необходими допълнителни проучвания за избягване на каквито и да е усложнения.

Общо взето оралното приложение на ABMK предоставя една допълнителна алтернативна терапевтична възможност за поддържане на естествения имунитет чрез засилване активността на NK клетките и за редуциране на много тежки странични ефекти от химиотерапията при пациентките с гинекологичен рак.

Литература

1. Lorincz AT, Temple GF, Kurman RJ et al. Oncogenic association of specific papillomavirus types with cervical neoplasia. J Natl Cancer Inst 1987;79:671-7.

2. zur Hausen H. Papillomaviruses in anogenital cancer as a model to understanding the role of viruses in human cancers. Cancer Res 1989;49:4677-81.

3. Cullen AP, Reid R, Campion M et al. Analysis of the physical state of different human papillomavirus DNAs in intraepithelial and invasive cervical neoplasia. J Virol 1991; 65:606-12.

4. Scheffner M, Werness BA, Heibregtse JM et al. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell 1990;63:1129-36.

5. Werness BА, Levine AJ, Howley PM. Association of HPV type 16 and 18 E6 protein with p53. Science 1990; 248: 76-9.

6. Menoli RC, Mantovani MS, Ribeiro LR et al. Antimutagenic effects of the mushroom Agaricus blazei Murill extracts on V79 ceils. Mutat Res 2001;496:5-13.

7. Itoh H, Ito H, Amano H et al Inhibitory action of a (l–>6)-beta-D-glucan-protein complex (FIII-2-b) isolated from Agaricus blazei Murill (“himcmatsutake”) on Meth A fibrosarcoma-bearing mice and its antitumor mechanism. Jpn J Pharmacol
   1994;66:265-71.

8. Ito H, Shimura K, Itoh H et al. Antitumor effects of a new polysaccharide-protein complex (ATOM) prepared from Agaricus blazei (Iwade strain 101) “Himcmatsutake” and its mechanisms in tumor-bearing mice. Anticancer Res 1997 17: 277-84.

9. Ebina T, Fujimiya Y. Antitumor effect of a peptide-glucan preparation extracted from Agaricus blazei in a double- grafted tumor system in mice. Biotherapy 1998;11:259-65.

10. Fujimiya Y, Suzuki Y, Katakura R et al. Tumor-specific cytocidal and immunopotentiating effects of relatively low molecular weight products derived from the basidiomycete, Agaricus blazei Murill. Anticancer Res 1999;19:113-8.

11. Takaku T, Kimura Y, Okuda H. Isolation of an antitumor compound from Agaiicus blazei Murill and its mechanism of action. ] Nutr
    2001;131:1409-13.

12. Fujimiya Y, Suzuki Y, Oshiman K et al. Selective tumoricidal effect of soluble proteoglucan extracted from the basidiomycete, Agaricus blazei Murill, mediated via natural killer cell activation and apoptosis. Cancer Immunol lmmunother 1998;46:147-59.

13. Hamuro ], Rollinghoff M, Wagner H. Induction of cytotoxic peritoneal exudate cells by Т-cell immune adjuvants of the beta (1 leads to 3) glucan-type lentinan and its analogues. Immunology 1980;39:551-9.

14. Seljelid R, Bogwald J, Hoffman J et al. A soluble beta-1, 3-D-glucan derivative potentiates the cytostatic and cytolytic capacity of mouse peritoneal macrophages in vitro, Imunopharmacology 1984;7:69-73.

15. Sherwood ER, Williams DL, McNamee RB et al. Soluble glucan and lymphokine-activated killer (LAK) cells in the periphery of experimental hepatic metastases. / Biol Response Mod 1988;7:185-98.

16. Oshiman K, Fujimiya Y, Ebina T et al. Orally administered beta-l,6-D-polyglucose extracted from Agaricus blazei results in tumor regression in tumor-bearing mice. Planta Med 2002;68:610-4.

17. Soiffer RJ, Murray C, Shapiro C et al. Expansion and manipulation of natural killer cells in patients with metastatic cancer by low-dose continuous infusion and intermittent bolus administration of interleukin-2. Clin Cancer Res 1996;2:493-9.

18. Sorimachi K, Akimoto K, Ikehara Y et al Secretion of TNF-alpha, IL-8 and nitric oxide by macrophages activated with Agaiicus blazei Murill fractions in vitro. Cell Struct Funct 2001;26:103-8.

W.-S. AHN*, D.-J. KIM**, G.-T. СНАЕ***, J.-M. LEE*, S.-M. BAE^§, J.-I. SIN^§, Y.-W. KIM^§, S.-E. NAMKOONG* & I. P. LEE*

*Department of Obstetrics and Gynecology; **Department of Medical Statistics; ***Institute of Chronic Disease; and ^§Catholic Research Institutes of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, South Korea

1 Горната по-лека част на кръвния съсирек, която се получава при забавяне на кръвосъсирването или центрофугиране (бел.пр.)
2 Microbeads са еднакви по размери полимерни частици с диаметър от 0.5 до 500 микрометра (бел.пр.)
3 FACS или флоу цитометрия е метод за оценка на протеините в клетъчната мембрана, на интрацелуларните протеини, на пептидите и ДНК, основаващ се на принципа на реакцията антиген-антитяло, при която антителата са флуоресцентно маркирани