Имуномодулиращата активност на Agaricus brasiliensis KA21 в мишки и хора доброволци

За да проучим имуностимулиращия ефект на плодните тела на естествено култивирана на открито Agaricus brasiliensis KA21 (т.е. A. blazei), ние проведохме проучвания на миши модели и хора доброволци. При мишките установихме следните ефекти: противотуморен, повишаващ левкоцитите, снижаващ хепатопатията и снижаващ последиците от ендотоксиновия шок. При хората наблюдавахме намаляване процента на телесната тлъстина, процента на мазнини в органите (!), нивото на холестерола и глюкозата в кръвта и повишаване в активността на клетките естествени убийци. Взети заедно, тези резултати силно подкрепят заключението, че плодното тяла на A. brasiliensis е полезна за здравето храна.

Ключови думи: A. brasiliensis-клинично проучване –студен воден екстракт -NK активност – култивиране на открито – безвредност

„Alternative medicine” е общ термин за ‘лекарство и лечение, които не са научно потвърдени или не се прилагат клинично в съвременната западна медицина’ (1-12). Диапазонът на алтернативната медицина варира в широки граници и включва традиционни лекарства и народни лчебни средства, както и нови терапии, които не се покриват от здравното застраховане. Процентът на хората в света, ползващи съвременната западна медицина, е учудващо нисък. Според Световната здравна организация (СЗО) 65-80% от здравните нужди се покриват от традиционни лекарства. ‘Mibyou’ е наскоро въведен термин, означаващ полуболен човек, чиито клинични лабораторни данни са на границата с тези на здравите хора. Обучението в здравословно хранене на частта ‘mibyou’ от населението е много важно за поддържане на общественото здраве от правителството.

В Япония, все повече хора се обръщат към алтернативната медицина главно по отношение на здравословните храни, каквито са аминокиселините, липидите, въглехидратите, растенията, водораслите и насекомите, бактериите, дрождите и гъбите. Гъби като Lentinula edodes, Ganoderma lucidum и Grifola frondosa се продават. Agaricus brasiliensis (A. blazei ss. Heinemann) е здравословна храна, която наскоро започна да привлича внимание. Има съобщения, че A. brasiliensis подобрява състояния, свързани с начина на живот, включително затлъстяване, хипертония и диабет и има противовъзпалително, антитуморно, рак инхибиращо и имуностимулиращо въздействие (13-18). Много от съобщенията обаче са или за проучвания при животни или клинични проучвания върху малко на брой случаи.

За отпечатъци и кореспонденция: Naohito Ohno, Professor, Tokyo University of Pharmacy and Life Science, School of Pharmacy, 1432-1 Horinouchi, Hachioji, Tokyo 192-0392, Japan. Tel: +81-426-76-5570; Fax: +81-426-76-5570; E-mail: ohnoпаo(wps.toyaku.ac.jp

Много от гъбите, наричани още макрофунги, са класифицирани като Basidiomycota, микроорганизми от по-висок ред. При обсъждане функциите на Basidiomycota е важно те да бъдат сравнявани при едни и същи условия, което се отнася не само до видовете, но и до щамовете, както и до методите на култивиране и преработка. Продуктите на Basidiomycota включват мицели, спори и плодни тела но всеки вид. Плодните тела и мицелите се използват нашироко в храните. Мицелът превъзхожда по качество плодното тяло, но е известно, че компонентите му са твърде различни. Има различни начини за доставка на плодни тела – събиране на естествено растящи по хълмове и полета гъби и култивиране на открито и на закрито.

Плодните тела на Agaricus brasiliensis KA21, използвана в това проучване са от гъби, култивирани в Бразилия на открито. Плодните тела бяха изсушени на въздуха чрез вентилатор с температура на издухвания въздух под 60° C, за да се дапази тяхната ензимна активност. Неотдавна ние изследвахме труктурата и антитуморната активнаст на полизахаридните фракции от плодното тяло и стигнахме до заключението, че силно разклонената им част l,3-3-glucan допринася съществено за тяхното действие. Ние приготвихме също студени и горещи водни екстракти (AgCWE и AgHWE) и ги изпитахме върху миши диабетичен модел C57B1 Ksj-db/ db. Установихме, че на този модел AgCWE показва много по-голяма фармакологична активност. Тези факти говорят в полза на това, че фармакологичните свойства на студения воден екстракт се различават от тези на горещия воден екстракт. Установихме също, че студеният воден екстракт съдържа ензими като полифенол оксидаза и пероксидаза (19-25). Таблица 1 показва, че A. brasiliensis KA21 има високо съдържание на протеин и фибри. Високо е съдържанието и на витамините Bl, B2, B6, ниацин, пантотенова киселина, фолиева киселина и биотин. A. brasiliensis KA21 съдържа много минерали, включително големи количества желязо, калий, фосфор, магнезий, цинк и мед и известно количество манган и селен. Освен това, когато гъбата се култивира на слънце, тя съдържа установими количества витамин D.

За постигане и поддържане на безопасност за гражданите, законът за храните се контролира строго. Неотдавна, лекари от Националната централна ракова болница в източна Япония съобщиха за три случая на сериозно чернодробно увреждане, свързани с прием на екстракт от A. blazei (26). Те казват, че е необходимо много допълващи и алтернативни лекарства, включително екстрактът на A. blazei да бъдат проучени в точно научно проектирани клинични опити, резултатите от които да бъдат на разположение на съответните специалисти. Съвсем наскоро една от здравословните ни храни, получена от A. blazed бе изтеглена поради установена енотоксичност за експериментални животни. Министерството на здравеопазването, труда и социалните грижи съобщи, че става дума само за един продукт и че в момента се изучават молекулярните механизми за токсичността му. Беше съобщено, че други сходни продукти не са показали такава токсичност. Агаритинът е добре известен токсичен метаболит на Agaricaceae, какъвто е Agaricus bisporus, поради което вниманието бе насочено към евентуална връзка на токсичността със съдържанието на агаритин. Но функцията и безопасността на продуктите, произлизащи от макрофунги и специално от Agaricaceae тряба винаги да бъдат определяни колкото е възможно по-точно.

Така че, за да се използват безопасно и ефективно алтернативните лекарства, включително A. brasiliensis, е важно задълбочено проучване и доказване на тяхната ефективност в клинични опити. При проучване на безвредността за хора ние установихме, че продължителното вземане на плодни тела на A. brasiliensis KA21, култивирани на открито, не дава никакви странични ефекти (22). В настоящето проучване ние демонстрираме имуномодулиращия ефект на A. brasiliensis KA21 в проучвания при животни и хора. Както беше вече казано, плодното тяло съдържа много ензими дори след изсушаването им. Ние приготвихме студени и горещи водни екстракти за орално приложение, за да изучим имуномодулирането върху миши модел. Пиенето на студени водни екстракти на A. brasiliensis е традиционен обичай в Бразилия. В клинично проучване ние определихма преди и след прилагането на A. brasiliensis KA2: телесното тегло, индекса на телесната маса (BMI), процента на телесната мазнина, процента тлъстина във вътрешните органи и биохимични нива в кръвта [общ белтък, кръвна глюкоза, холестерол, неутрални мазнини, глутамат оксалоацетатна трансаминаза (GOT), глутамат пироватна трансаминаза (GPT) и глутамат трансфераза (γ-GTP)] и активност на клетките естествени убийци (NK).

Методи

Плодни тела на Agaricus brasiliensis

Гъби от щам KA21 бяха култивирани на открито в Бразилия и плодните им тела бяха измити и изсушени с горещ въздух, имащ температура 60^оС или по-ниска.

Измерване на съставките

Всички съставки с изключение на агаритина бяха измерени от Japan Food Research Laboratories, Shibuya, Tokyo при използване на стандартните протоколи, препоръчвани от Ресурсния съвет на Агенцията по наука и технологии на Япония Концентрацията на агаритин беше измерена с HPLC/MS/MS от MASIS Inc, Minamitusgaru, Aomori.

Приготвяне на горещ воден екстракт (AgHWE) и студен воден екстракт от (AgCWE) of A. brasiliensis

Плодни тела на KA21 (по 100g всяко) бяха смлени с домашна кафемелачка, дабавяне към 0.1 g/ml физиологичен разтвор (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd), и екстрахирани в автоклав (120°С, 20 мин) или със студена вода (4°C, 1 ден). След центрофугиране супурнатантът беше обозначен съответно AgHWE или AgCWE. До използването им екстрактите се пазеха замразени при -20°C.

Орално приложение на мишки

AgHWE и AgCWE приготвени по описания метод бяха прилагани орално на мишки в продължение на 2 седмици, след което се определяха клетъчният брой и клетъчната популация.

Туморен модел на мишки

Солидна форма на тумор: Клетки от саркома 180 бяха приложени подкожно в слабините на мишки ICR (1 x 10⁶/мишка) на ден 0. AgHWE или AgCWE бяха прилагани орално (p.o.) ежедневно в продължение на 35 дни. Стандартният β-глюкан, „Sonifilan” (SPG) бе приложен интраперитонеално на 7-ми, 9-ти и 11-ти ден. След 35 дни мишките бяха умъртвени и бе измерено теглото на солидния тумор.

Продукция на възпалителен цитокин в ‘инструктирани’ мишки

Мишки Balb/c mice бяха ‘инструктирани’ със стандартен β-глюкан, SCG (200 μg/мишка) от Sparassis crispa на ден 0 и AgHWE или AgCWE бяха прилагани орално ежедневно в продължение на 1 седмица. Една седмица по-късно им бе приложен венозно бактериален липополизахарид (LPS, l0μg/мишка), а 90 минути след това им бе взет серум и се измериха чрез тест ELISA нивото на серумния TNF-α и нивото на експресия на IL-6. Антителата и стандартите бяха закупени от Pharmingen Ltd.

Конканавалин А-индуцирано чернодробно увреждане у мишки

AgHWE или AgCWE бяха прилагани в продължение на няколко дни орално на мишки. Един ден след последния прием бе предизвикано чернодробно увреждане чрез венозно инжектиране на Конканавалин А (Con A). Три часа след приложението на Con A бе измерено серумното ниво на интерлевкин 6. GOT и GPT бяха измерени 24 часа след приложението на Con A.

Клинични проучвания при хора

Беше проведено проучване при 31 здрави лица, които не вземаха никакви лекарства по време на проучването и не бяха вземали никакви лекарства непосредствено преди това.

Ние им обяснихме писмено същността на проучването и получихме тяхното съгласие да използваме резултатите от тестовете. Лицата бяха разделени на три групи. На групи 2 и 3 (общо 20 души) бе приложена обикновената доза, а на група 1 (11 лица) бе приложена три пъти по-висока доза (група за проучване на безопасността) от A. brasiliensis.

Забележка: В 100g сухо тегло, измерено в Japan Food Research laboratories (Японските лабороратории за изследване на храни). Агаритинът бе измерен от лаборатории MASIS по метода HPLC.

Група 1. В продължение на 6 месеца от 31 май до 26 ноември 2004г., 11-те лица (средна възраст 43.6 ± 12.6 години, 6 мъже, 5 жени) бяха помолени да вземат по 30 таблетки/ден (разделени на три приема; всяка таблетка съдържаше по 300 mg A. brasiliensis), които се равняват на три обикновени дози. След това измерихме и анализирахме субективните промени в тяхното състояние, чернодробната функция (GOT, GPT, γ-GTP), бъбречната функция [уреен азот в кръвта (BUN), креатинин] и нутриционен статус (общ протеин).

Група 2. В продължение на 3 месеца от 12 април до 8 юли 2005, 12 лица (средна възраст 45.3 ±8.1 години, 9 мъже, 3 жени) бяха помолени да вземат обикновената доза от 10 таблетки/ден (разделени на два приема; всяка таблетка съдържаше по 300 mg A. brasiliensis). След това измерихме телесното им тегло, BMI, процента на телесната мазнина, процента тлъстина във вътрешните органи и биохимични нива в кръвта (общ белтък, кръвна глюкоза, холестерол, неутрални мазнини, GOT, GPT и γ -GTP).

Група 3. В продължение на 3 месеца от май до август 2005г., 8 лица (средна възраст 22.3 ±0.5 години 6 мъже, 2жени) бяха помолени да вземат обикновената доза, след което измерихме имунната им функция (брой на клетките NK, NK клетъчна активност). При измерване на имунната функция ние разделихме осемте лица на две групи по двойно-сляп маниер – A. brasiliensis група и плацебо група, които приемаха в продължение на 7 дни по 10 таблетки/ден (разделени на два приема; всяка таблетка съдържаше по 300 mg A. brasiliensis), след което определихме броя на клетките NK и NK клетъчната активност в периферната кръв. След двумесечно прекъсване на лекарството проучването бе повторено, като таблетките бяха разменени между групите (crossover). Ние анализирахме клетъчната фракция на периферната кръв като гледахме на мононуклеарните клетки с CD3-CD16 CD56⁺ като на NK клетки. Прилагайки обикновения метод, ние измерихме NK клетъчната активност по 4 часовото освобождаване на ⁵¹Cr, като използвахме туморните клетки K562 като мишени при съотношение между ефекторните клетки и клетките мишени (E/T) 20 или 10 (съотношението на смесване на мононуклеарните клетки и клетките K562 е 20 или 10).

Статистически анализ

За оценка на статистическата значимост бе използван двоен t-тест. При всички анализи P<0,05 беше считано за значимо.

Резултати

Химичен анализ на A. brasiliensis KA21 за оценка на безопасността

Преди да започнем животинските и човешките експерименти ние направихме скрининг на химическия състав и добавките към препарата. Химическият състав и нутриентите са показани на таблица 1. Наскоро една основна токсична съставка на гъбите Agaricaceae ‘агаритин’ привлече внимание с това, че е показала тумор промотиращ ефект в плъхове. Измерихме съдържанието на агаритин в A. brasiliensis KA21, което се оказа малко (15.3ppm). Съдържанието на тежките метали, такива като олово и живак се оказа под нивото на откриваемост. Изследвахме гъбата за триста пестициди и не открихме нито един (данните не са показани). Съдържанието на β-глюкан в A. brasiliensis KA21, измерено в Японските изследователски лаборатории по храните, беше 2.4g 100 g-1. Ние изучихме прецизно структурата на полизахаридните фракции на KA21 и определихме, че основната структура на β-глюкана, имаща имуномодулираща активност е β -1,6-свързан глюкан със силно разклонен β -l,3-сегмент (20).

За макрофунгите е добре известно, че съдържат витамин D. В KA21 се установи съдържание на този витамин 56.7 μg 100g-1 (= ca. 2250IU 100g-1). Същият щам, култивиран на закрито в къщата не съдържаше откриваемо количество витамин D (данните не са паказани). Добре известно е, че концентрацията на витамин D зависи силно от излагането на слънце. Съдържанието на витамин D в KA21 отразява добре условията на култивиране на открито и на слънчево място. Тези химични и аналитични данни показват, че при проучванията на животни и хора, A. brasiliensis KA21 е била безопасна за тях.

Параметри и ефекти върху експерименатлни животни

Ефект върху мишки от нормална инбредна линия

За опитите с животни бяха приготвени AgCWE и AgHWE. При орално прилагане на AgCWE или AgHWE в продължение на 2 седмици на здрави мишки (C3H/HeN) в доза 20mg/мишка броят на клетките в тимуса оставаше непроменен (данните не са показани), но броят на клетките в далака се увеличаваше в групата, приемаща.

Клетките бяха двойно оцветени с CD4/CD8α, αβ/γδ или CD3/B220, а съотношенията на клетъчните популации бяха изчислени след измерване с флоу цитометър. Не се наблюдаваха никакви забележими промени в тимуса (данните не са показани), а делът на CD4+ в далака нарастна значително в групата, приемала AgHWE.

Антитуморна активност AgCWE и AgHWE, приложени орално на мишки с трансплантиран сарком 180

Ние оценихме антитуморната активност на A. brasiliensis върху солидния тумор сарком 180, който е стандартната система за измерванена на антитуморния ефект при мишки. Сонифилан (SPG) беше използван като стандартен материал. Оралното приложение на AgCWE или AgHWE в продължение на 35 дни доведе до потискане на туморния растеж (Таблица 2).

Таблица 2. Антитуморен ефект на екстракти от A. hnisiliensis върху солидна форма на сарком 180 при мишки ICR

Наименование	Доза (mg)	Време	Път	CR/n	Тегло на тумора средно/SD (g)	% на инхибиране	t-тест
Контрола				0/12	8.6 ±4.3	0.0
SPG	0.l	3	i.p.	7/П	0.4± 1.1	95	<0.001
Контрола				0/10	15.0 ±6.5	0
AgCWE	2	35	p.o.	0/10	9.6 ±6.5	36	<0.05
AgHWE	2	35	p.o.	0/10	7.9 ±2.5	47	<0.01

Забележка: Доза за мишка; време, дни 7,9, 11; CR/n, брой на мишките, свободни от тумор /общо мишки. SPG, Стандартенβ-глюкан като позитивна контрола.

Предпазване срещу Конканавалин А-индуцирано чернодробно увреждане чрез орално приложение на мишки на AgCWE и AgHWE

Венозното прилагане на растителния лецитин Con A, предизвиква у мишки остра хепатопатия. Ние приложихве AgCWE или AgHWE орално като предварително третиране и после отчетохме ефекта на Con A за предизвикване на хепатопатия. Установихме, че след прилагане на 200 μl AgCWE или AgHWE в продължение на 7 дни като предварително третиране, GOT намалява значително в групата, получила AgCWE. Подобна тенденция наблюдавахме и вглупата, получила AgHWE. При повишаване на дозата до 600 μl в продължение на 7 дни, ефектът стана още по-забележим. GPT спадна по подобен начин (данните не са показани).

Подобни проучвания бяха проведени при използване на различни начини на приложение при няколко различни миши линии и във всички случаи се наблюдаваше тенденция на намаляване. Резилтатите от всички проучвания показват, че A. brasiliensis KA21 предпазва мишките от чернодробно увреждане.

Приложен орално, липополизахаридът на A. brasiliensis KA2I предпазва от недостатъчност на много органи

След това, за да определим хепатоцелуларния протективен ефект на AgCWE и AgHWE, ние изучихме цитокиновата продукцията, индуцирана от приложението на бактериалния ендотоксин, LPS, който при тежки инфекции причинява множествена органна недостатъчност. Нивата на TNF-α и IL-6, генерирани в резултат на приложението на LPS administration намаляха и в двете групи, което показва, че A. brasiliensis предпазва органите като контролира нивото на произвежданите цитокини.

Клинично проучване

Безопасност на A. brasiliensis

Преди да определим безопасността на A. brasiliensis KA21, ние проведохме предварителен експеримент върху 13 лица, които получаваха обикновената доза в продължение на три месеца и измерихме промените в общите им клинични параметри. Средното телесно тегло (71.2—> 70.9kg), размерът на талията (85.4—> 83.5cm), процентът на телесната мазнина (34.4-33.0%) и BMI (27.8-27.6) не показаха никакъв клиничен знак на заболяване от използването й. За да определим прецизно безопасността на A. brasiliensis KA21, ние приложихме три пъти по-висока доза от обикновената на 11 лица в продължение на 6 месеца (група 1, виж ‘Методи’) и измерихме и анализирахме субективните промени в състоянието, чернодробната функция, бъбречната функция и нутриционалните условия. След измерване на биохимичните параметри ние не открихме никаква статистически значима разлика в параметрите преди и след приложението на гъбата и никакви странични ефекти от дълготрайното й приложение (Таблица 3).

Ефект на A. brasiliensis върху биохимичните параметри, свързани със затлъстяване и диабет

За да оценим ефекта на A. brasiliensis KA21 върху болестите, свързани с начина на живот, ние приложихме обикновената доза на 12 лица (група 2, виж ‘Методи’) в продължение на три месеца и сравнихме клиничните биохимични данни. Резултатите са следните: (i) След приложението се наблюдаваше значително намаляване на телесното тегло и BMI (Р

Таблица 3. Безопасност на A. brasiliensis KA2I при доброволци

За да анализираме данните по-прецизно, разделихме доброволците въз основа на нивото на общия им холестерол на две групи: група с нормални стойности (T-CHO 200 mg/dl) за сравнение. Никаква промяна не бе наблюдавана след приложението в групата с T-CHO < 200 mg/dl group но в групата с T-CHO > 200 mg/dl имаше намаление.

Разделихме лицата според нивото на неутралните мазнини в кръвта на група с нормални стойности (TG < 120 mg/dl) и група с „mibyou” стойности (TG > 120 mg/dl) за сравнение. В първата нямаше никаква промяна, но във втората се наблюдаваше снижение на неутралните мазнини след приема на гъбата.

Подобрение на чернодробнота функция след приложение на A. brasiliensis

За да определим чернодробната функция, ние сравнихме стойностите на GOT, GPT и γ-GTP на лицата, за които говорихме в преднишната част. Когато направихме сравнение между всички 12 лица, нямаше никаква разлика между стойностите преди и след прилагането на гъбата. Но когато ги разделихме на две групи въз основа на стойностите на GOT – нормална и „mibyou”, се оказа, че след приложението на гъбата средната стойност на GOT в нормалната група (G0T<25IUl^-1) е нарастнала леко, а е намаляла в групата „mibyou” (GOT ≥ 25IUl^-1), но разликата не е статистически значима. Средната стойност на GPT след приложението се е повишила в нормалната група (GPT< 25IUl^-1), в групата „mibyou” (GPT ≥ 25 IUl^-1) е намаляла леко, но разликата не е статистически значима. Средната стойност на γ-GTP е намаляла леко в групата с нармално ниво (γ-GTP< 30IUl^-1), а в групата „mibyou” (γ-GTP ≥ 30 IUl^-1) почти не се е променила.

В заключение, нашите дани показват, че при болестите, свързани с начина на живот, нивата на липидите и глюкозата в кръвта имат низходяща тенденция. Освен това се забелязва и подобряване на чернодробната функция.

Модулиране на клетките естествени убийци от A. brasiliensis

За да оценим ефекта на A. brasiliensis KA21 върху имунната функция, ние определихме клетъчния брой на NK и изучихме тяхната функция при осем лица в двойно сляп експериментален протокол, който е даден в ‘Методи’ (група 3, виж ‘Методи’). На осемте лица бе приложена обикновена доза или плацебо в продължение на 7 дни, след което бяха сравнени броя на техните NK клетки и активността на периферната им кръв.

Ефект на A. brasiliensis върху броя на NK клетките

Беше направено сравнение на броя на NK клетките преди и след прилагането на A. brasiliensis и плацебо. Не се установиха статистически значими различия между двете групи.

Повишаване в активността на NK клетките от приложението на A. brasiliensis KA2I

Преди прилагането не бяха установени никакви значими различия между A. brasiliensis групата и плацебо групата. След приложението установихме статистически значими различия между двете групи с P

Обсъждане

В обществото на Япония се наблюдава бързо свръхзастаряване, намаляване на работната сила, изразходване и несигурност на приходите и повишена международна конкуренция със съседните азиатски нации. Тъй като драматичното нарастване в броя на по-възрастните пациенти е неизбежно, очаква се системата за социално осигуряване да се претовари финансово, а загрижеността на пациентите и потребителите за техните права да се засили поради засилващото се финансово бреме върху тях. Счита се, че генетичното предразположение е в основата на развитието на състоянията, свързани с начина на живот, какнито са диабетът, хиперлипидемията и ракът, но има и още няколко фактора, които определят тяхното развитие. Ето защо начинът на живот е тясно свързан с ръзвитието на такива състояния и болести. От друга страна има необходимост от намаляване на значително увеличените медицински разходи. Дискутира се, защо трябва да плащаме за медицинските разходи на хора, които не водят здравословен живот. Броят на хората, които още не са болни, ноне са и здрави, чието здраве е влошено или са ‘mibyou’, нараства с увеличаваща се скорост (27,28). Трудно е да се поддържа навикът за редовно хранене в условията на стрес в ежедневието ни. Подобряването на диетата чрез консумиране на функционални храни изглежда допринася за подобряване здравето на хората, при които то е влошено, както и за предотвратяване на болести, свързани с начина на живот.

В Япония има много функционални храни, но те са скъпи и за да може всеки потребител да си избере най-добрата за него храна, е необходима точна информация. Трябва да бъдат обявявани всички параметри на безопасност, ценообразуването, доказателства за действието на храните, а също и техните вкусови качества.

От стотици години гъбите са част от ориенталската медицина и се счетат за благоприятстващи здравето. Повечето традиционни познания за медицинските свойства на гъбите произхождатот Далечния Изток, Япония, Китай, Корея и Русия. Най-забележителният факт е, че лентинанът от L. edodes, сонифиланът от Schizophyllum commune и крестинът от Coriorus versicolor бяха одобрени като противоракови лекарства, действащи чрез имуностимулация. На пазара има много продукти от гъби, които са разрешени като здравословни храни и с които непрекъсното се провеждат базови и клинични изследвания (29-41).

Понастоящем в света са познати около 80 000 вида фунги, но се предполага, че в действителност съществуват 1 500 000 вида, включително все още непознати. Класификацията на фунгите включва царство, разред, клас, род и видове. Много фунги се класифицират като Basidiomycota или Ascomycota, а други принадлежат към царство Protozoa или царство Chromista. Фунгите включват гъби, плесени и дрожди, които се различават чувствително по външен вид и големина. Тъй като гъбите са твърде големи, за да бъдат считани за микроорганизми, те се наричат макрофунги. Лишеите, от които два или повече живеят в симбиотични отношения, също се включват към фунгите. Фунгите имат както полови форми (например морфологията на гъбите), така и безполови форми на регенерация (например морфологията на мицела) и всяка от тях се използва взависимост от промените в околната среда. Но не всички фунги са холоморфни (съществуват в двете форми). Тяхната номенклатура е също характерна. В името може да бъде отразено нещо свързано с откриването на фунгуса. Един фунгус може да носи различни имена в половата си (телеоморфна) и в безполовата си (анаморфна) форма на регенерация. Фунгите и по-специално гъбите са култивирани и разпространявани продукти и техният състав е анализиран. Тридесет и шест храни са класифицирани като „гъби” в „Standard Tables of Food Composition in Japan” (пето издание). Характерният нутриционален състав на гъбите включва фибри, глюкоза и захарни алкохоли, органични киселини, мастни киселини, неорганични субстанции, витамини, свободни аминокиселин, горчиви и пикантни компоненти, ароматни компоненти, ензми, биофилактични субстанции, фармакологично активни субстанции и токсични компоненти. Освен това, плесените и дрождите са сродни с някои ферментирали храни. Много различни храни, включително саке (оризово вино), мисо (бобов пастет), соевият сос, сиренето и катсуобуши (сушена риба тон) се произвеждат с помощта на еукариотни микроорганизми. Фунгите продуцират много вторични метаболити, които се използват като лекарства или суровини за лекарства, пример за което е пеницилинът.

Що се отнася до ядливите гъби, някои се консумират сурови, а култивирани хифи и бульон от култивирането им се обработват и разпространяват за употреба като хранителни добавки. Въпреки че са от същата гъба обаче няма доказателства, че съставките им са същите като тези на култивираните плодни тела. В началото на 1980-те години ние проведохме проучвания върху животни с цел да сравним макромолекулните компоненти на плодните тела, мицелите и ферментните продукти на G. frondosa. Количеството и качеството на компонентите във всеки от екстрактите бяха различни и това се отразяваше на действието им (29-32). Grifola frondosa е добре изучена в Япония и някои други страни. Интересно е, че основните активни компоненти се различават в зависимост от изучаваната група (33 -37). При сравняване на продуктите от гъби и мицели бе установено, че живите гъби се различават от сухите продукти. Изсушените продукти са за предпочитане от гледна точка на стабилността на доставките, но компонентите се променят в зависимост от използвания метод за изсушаване. Вероятно е също така компонентите да се различават ако са използване различни фунгални щамове. Така че, препаратите от един и същ вид гъба могат да се различават съществено в зависимост от начина им на обработка.

Ако искаме да дискутираме или оценяваме компоненти и фармакологично действие, трябва да проведем сравнението при точно определени условия, особено когата провеждаме експерименти с животни.

Агаритинът (N-[y-L-(+)-glutamyl]-4-hydroxymethylphe-nylhydrazine) бе идентифициран в плодни тела от култивирани гъби, принадлежащи към род Agaricus, включително комерсиалната A. bisporus и тясно родствени с нея видове (42-46). Счита се, че йонът 4-(hydroxymethyl) benzenediazonium, който е мутагенен се образува при метаболизиране на агаритина. Агаритинът е най-много, обикновено в количества между 200 и 400 μg g^-1 в прясно тегло, 1000-2500 μg g^-1 в сухо тегло от култивираните гъби. Наскоро бе измерен агаритина в проби и продукти от A. brasiliensis (A, blazei). Съдържанието му беше между 112 и 1791 μg g^-1 в сухо тегло (47). В настоящето проучване ние открихме в препарата, направен от A. brasiliensis KA21 само ниски концентрации на агаритин (15.3ppm; 15.3 μg g^-1). Това е <1/100 от средното количество в A. bisporus. Известно е, че съдържанието на агаритин варира значително в зависимост от начина на обработване. Обработката в домашни условия (напр. варене, пържене, загряване в микровълнова фурна или изсушаване) намалява с 50% и дори повече съдържанието му (48). Освен това, наскоро бе показано, че агаритина се разпада във вода в зависимост от количеството на кислорода в нея (42,43). Дълго се дискутираше възможната токсичност и канцерогенност на агаритина (44,45). Заключенията са все още противоречиви. Toth и сътрудници (46,49-51) предприеха опити за оценка възможната канцерогенна активност на фенилхидразините и близки до тях съединения в A. bisporus. Техните проучвания показаха, че повечето фенилхидразини и близките до тях съединения са канцерогенни за швейцарската мишка албиносЕдинственото съединение, което се е оказало отрицателно е агаритинът, което внесе значително объркване в интерпретацията на данните за канцерогенността. Освен това тези проучвания принадлежат към консервативния модел на риска. Без епидемиологични данни не може да се направи оценка на канцерогенността на агаритина за хора.

Ние анализирахме различни аспекти на A. brasiliensis KA21 и направихме съобщение за β-глюкана, ензимите полифенолоксидаза, пероксидаза и β-l,3-глюканаза. Съдържанието на β-глюкан в A. brasiliensis KA21 , измерено от Японските изследователски лаборатории по храните беше 12.4g 100 g-¹. Ние изучихме прецизно структурата на полизахаридните фракции на KA21 и определихме, че основната структура на β-глюкана, показващ имуномодулираща активност е β-1,6-свързан глюкан със силно разклонен β-l,3-сегмент (20). По време на това проучване ние приготвихме горещ воден екстракт, студен алкален екстракт и горещ алкален екстракт и анялезеряхуме пализахаридната структура на всички тези фракции. Много интересно е, че всички фракции показаха твърде подобни структурни характеристики с основна връзка β-1,6-свързан глюкан. Според тези данни главният полизахариеден компонент на A. brasiliensis е β-1,6-свързан глюканкоето е в съответствие с предишното проучване. Както споменахме обаче, резултатите от едно ограничено проучване върху химичното разпадане показаха, че за антитутуморна активност β-1,6 връзка е необходимо наличие и на β-l,3-връзки. Но това заключение е все още предварително и за установяване на структурните активности са необходими проучвания при хора.

Това проучване показа, че гъбата е богата на витамини, а когато се отглежда на открито , съдържа откриваеми концентрации от витамин D. Витамин D е добре известен витамин в макрофунгите и KA21 съдържаше 56.7μg 100g^-1 в сухо тегло. В паралелни експерименти, витамин D в мицела на тази гъба, култивиран в течна среда и в плодното тяло на A. blazei, внесена от Китай, беше в количество, по-малко от границата на откриваемост (0.7μg 100g^-1) Големите разлики на витамин D в тези продукти отразява добре условията на култивиране на открито и на слънчево място. Връзката между съдържанието на витамин D и излагането на слънце е демонстрирана при различни макрофунги (52). Според дефиницията от наръчника с наредби за здравословните храни на Япония, храна,съдържаща повече от 1,5μg 100g^-1 (= 60IU 100g^-1) витамин D се определя като храна с високо съдържание на витамин D. Следователно, KA21 е храна с високо съдържание на витамин D. Микронутриентите, каквито са витамините и минералите подобряват метаболизма на отпадните продукти, въглехидратите и липидите чрез активиране на клетките и и подобряват резистентността към инсулин чрез намаляване на кръмната захар. Фибрите и ненаситените мастни киселини снижават кръвното налягане и засилват дехолестеролизацията. KA21 съдържа и други микронутриенти. Ето защо тя е добра за здравето по много различни причини.

Междудругото, анализирайки активните съставки на корена на билката bupleurum[1] , която е сурово лекарство, ние открихме, че полифенолите полимеризирани от ензими, имат силен имуностимулиращ ефект (53-55). A. brasiliensis също има доста ензими, полимеризиращи полифенолите (23,24). Полимеризираните от тези ензими полифеноли може би са активни компоненти на тази гъба. При нашите клинични изпитания ние наблюдавахме в групата „mibyou” намаляване на телесното тегло, на BMI, на процента на телесните мазнини, на процента на тлъстините във вътрешните органи, на кръвната захар и тенденция към намаляване на кръвните нива на холестерола, неутралните мазнини, GOT, GPT и γ-GTP. Според по-раншни проучвания върху компонентите на тази гъба, всички полизахариди, ензими, витамини и минелрали може би участват в нормализирането на биохимичните тест резултати.

В това проучване измерихме имунната функция на мишки. Когато сравнихме броя и популацията на имунокомпетентните клетки след орално прилагане на AgCWE или AgHWE на здрави мишки в продължение на 2 седмици, установихме, че процентът на далачните CD4⁺T клетки е нарастнал в AgHWE групата и нарастване в броя на далачните клетки в групата AgCWE. Нещо повече, AgCWE и AgHWE показаха антитуморни ефекти, а AgCWE предотвратяваше хепатопатията, индуцирана с Con А и потискаще продукцията на цитокини, индуцирана от LPS. Клетките CD4⁺T се подразделят на тип 1 хелперни T клетки (Thl) и тип 2 хелперни T клетки (Th2) въз основа на T-клетъчна антигенна стимулация antigen stimulation. Счита се, че Thl имат по-важен принос за антитуморния ефект. За Thl се знае, че инфилтрират добре локалните места, демонстрират силна цитотоксичност и способност за продукция на цитокини и индуцират пълна регресия на туморите посредством локално индуциране на CTL, който има способност да продуцира IFN-γ (56-58). Вероятно е антитуморният ефект на A. brasiliensis да е тясно свързан с нарастване в броя на CD4⁺T клетките.

Тъй като промените в имуноцитите бяха наблюдавани след орално приложение на A. brasiliensis на здрави мишки, очаква се ежедневият прием на A. brasiliensis да предпазва от имунорегулаторна недостатъчност.

Agaricus brasiliensis не позволява настъпването на множествена органна дисфункция, проявяваща се с изключително високи нива на цитокини в кръвта. Желателно е цитокините да се продуцират в количествата, които са необходими. В модели като например причинената от LPS продукция на цитокини, A. brasiliensis контролира прекомернатаил продукция. A. brasiliensis може не само да промотира, но и да контролира имунитета, което се счита желан ефект.

От ефектите на A. brasiliensis върху имунната функция, ние изследвахме промените в дела на NK клетките от периферните мононуклеарни клетки и активността на NK клетките при хора. Както в групата с A. brasiliensis, така и в плацебо групата, след едноседмично приложение нямаше никакви значителни промени в броя на NK клетките и делът им от периферните мононуклеарни клетки. При проучване на отделните случаи се видя, че при почти всички случаи с приемане на A. brasiliensis има повишаване в активността на NK клетките, като стерента на повишаването е различна във всеки от тях.

Измерването на активността на NK клетките се прави много често при експериментите и с животни, и с хора, тъй като тези клетки играят ключова роля за естествения имунитет, а измерването на цитотоксичността е надежден начин за оценка, имащ добра репродуктивност (5). Имунната функция се влияе от NK клетките и от различни лимфоцити и хуморални фактори, включително антитела, комплемент и цитокини. as well as various lymphocyte and humoral factors including antibodies, complement and cytokines. Няколко публикации демонстрират способността на макрофугални продукти да усилват активността на NK клетките (59-63).

Ефектът на A. brasiliensis върху степента на активиране на NC клетките варира значително при отделните индивиди. Неотдавна беше изяснено, че ефективността, както и появата на странични ефекти при който и да е медикамент е различин при всеки индивид. Това се обяснява отчасти с полиморфизма и унаследяването на CYP-свързаните гени, които са ензимна група за метаболизиране на лекарства (64,65). От друга страна, много каузативни гени могат да бъдат открити при заболявания, свързани с имунитета, някои от които са полиморфни. Възможно е полиморфизмът да е свързан с индивидуалните различия в ефектите на A. brasiliensis. Проучванията върху рецепторите за компонентите на гъбите са засега малко. Dectin-i бе наскоро определен като рецептор за β-глюкана от клетъчната стена, който е основен компонент на гъбите (66 -68). Изясни се връзката между полиморфизма на рецептора за патогени и болестта (69,70). Може би има връзка между ефекта на A. brasiliensis и полиморфизма на рецепторния ген. Необходими са още анализи в тази насока.

С помощта на базови и клинични изследвания ние потвърдихме, че A. brasiliensis може да подпомогне за намаляване на симптомите на болестите, свързани с начина на живот чрез своите антитуморни и подобряващи имунитета ефекти и че е полезна здравословна храна за хората с „mibyou” (първична превенция).

Съвсем наскоро една от здравословните храни, произведена от A. brazei, бе изтеглена от употреба поради индуциране на генотоксичност в експериментални животни. Министерството на здравеопазването, труда и социалните грижи съобщи, че това се отнася само за един продукт и молекулните механизми на явлението се проучват. Клиничните данни от изпитването на KA21 показаха, че гъбата е безопасна за хора. Ние не наблюдавахем никакви странични ефекти. Както вече заявихме, съдържанието и формакологичното действие на гъбите, дори и по отношение на един и същ вид, зависят в значителна степен от условията на култивиране, както е например с витамин D. Освеун това, при преработката протеините могат да се разградят. За защита на здравето на хората е необходимо законодателствато да бъде много точно по отношение на всяка здравословна храна. И тъй като в рода Agaricaceae има много видове, които се използват като функционални храни, ще са необходими още много проучвания. Нашето проучване помогна за разбирането, че гъбите agaricaceae са безопасни и полезни за човешкото здраве.

Заключение

(i) Нашите базови проучвания при използване на миши модел показаха, че A. brasiliensis има противотуморен, противовъзпалителен и протективен хепатоцелуларен ефект. Предполагаме, че тези ефекти са свързани с повишаване в броя на Т хелперните клетки и засилване на активността на NK клетките.

(ii) При клинични проучвания на доброволци ние установихме, че A. brasiliensis понижава значително телесното тегло, BMI, процента на телесните мазнини, процента на мазнините във вътрешните органи и нивото на кръвната захар и редуцира затлъстяването. Гъбата намалява също нивото на кръвния холестерол и неутралните мазнини и активира имунната функция на пациенти „mibyou”.

Ying Liu¹, Yasushi Fukuwatari¹, Ko Okumura², Kazuyoshi Takeda², Ken-ichi Ishibashi³, Mai Furukawa³, Naohito Ohno³, Kazu Mori⁴, Ming Gao⁴ and Masuro Motoi⁵

¹Mibyou Medical Research Center, Institute of Preventive Medicine, Tokyo, Japan, department of Immunology, School of Medicine, Juntendo University School of Medicine, Tokyo, Japan, laboratory for Immunopharmacoiogy of Microbial Products, School of Pharmacy, Tokyo University of Pharmacy and Life Science, Tokyo, Japan, department of Acupuncture and Moxibustion, Suzuka University of Medical Science and Mie, Japan, and ⁵Toei Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan

Литература:

1. Kidd PM. The use of mushroom glucans and proteoglycans in cancer treatment. Altern Med Rev 2000;5:4-27.

2. Mayell M. Maitake extracts and their therapeutic potential. Altern Med Rev 2001;6:48-60.

3. Ventura C. CAM and cell fate targeting: molecular and energetic insights into cell growth and differentiation. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:277 -83.

4. Cooper EL. Bioprospecting: a CAM Frontier. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:1-3.

5. Takeda K, Okumura K. CAM and NK cells. Evid Based Complement Alternat Med 2004;1:17-27.

6. Shimazawa M, Chikamatsu S, Morimoto N, Mishima S. Nagai H, Hara H. Neuroprotection by Brazilian green propolis against in vitro

and in vivo ischemic neuronal damage. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:201-7.

7. Cooper EL. CAM. cCAM, bioprospecting: the 21 st cenlury pyramid. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:125-7.

8. Lindequis U, Timo H, Niedermeyer J, Julich WD. The pharmacological potential of mushrooms. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:285-99.

9. Tarasawa K. Evidence-based reconstruction of kampo medicine: Part I Is kampo CAM? Evid Based Complement Alternat Med 2004; 1:11-16.

10. Kaminogawa S, Nanno M. Modulation оГ immune functions by foods. Evid Based Complement Alternat Med 2004;1:241-50.

1I.Alsumi K. Is alternative medicine really effective? Alternative Medicine 2000 (на японски).

12.Atsumi K. Recommendations of Alternative Medicine. Japan Medical Planning 2000 (на японски),

13.Huan SJ, Mau JL. Antioxidant properties of methanolic extracts from Agaricus blazei with various doses of y-irradiation. Food Set Techno! 2006;39:707 -16.

14.Bellini MF, Angeli JPF, Matuo R, Terezan AP, Ribeiro LR, Mantovani MS. Antigenotoxicity of Agaricus blazei mushroom organic and aqueous extracts in chromosomal aberration and cytokinesis block micronuclcus assays in CHO-kl and HTC cells, Toxicol in Vitro 2006;20:355-60.

15.Zhong M, Tai A, Yamamoto I. In vitro augmentation of natural killer activity and interferon-y production in murine spleen cells with agaricus blazei fruiting body fractions. Biosci Biotechnol Biochem 2005;69:2466-9.

16.Ellertsen LK, Holland G, Johnson E, Grinde B. Effect of a medicinal extract from Agaricus blazei Muriil on gene expression in a human monocyte cell line as examined by microarrays and immuno assays. Int Immunopharmacol 2005;6:133-43,

17.Kobayashi H, Yoshida R, Kanada Y, Fukuda Y, Yagyu T, Inagaki K, el al. Suppressing effects of daily oral supplementation of beta-glucan extracted from Agaricus blazei Muriil on sponta­neous and peritoneal disseminated metastasis in mouse model. J Cancer Res Clin Oncol 2005;131:527-38.

18.Ker YB, Chen KC, Chyau CC, Chen CC, Guo JH, Hsich CL, et al. Antioxidant capability of polysaccharides fractionated from submerge-cultured Agaricus blazei mycelia. J Agric Food Chem 2005;53:7052-8.

19.Ohno N, Furukawa M, Miura NN, Adachi Y, Motoi M, Yadomae T. Antitumor beta-glucan from the cultured fruit body of Agaricus blazei. Biol Pharm Bulletin 2001;24:820 -8.

20.Ohno N, Akanuma AM, Miura NN, Adachi Y, Motoi M. (l-3)-beta-glucan in the fruit bodies of Agaricus blazei. Pharm Pharmacol Lett 2001; 11:87-90.

21.Motoi M, Ishibashi K, Mizukami O, Miura NN, Adachi Y, Ohno N. Anti beta-glucan antibody in cancer patients (preliminary report). Int J Med Mushrooms 2004;6:41-48.

22.Liu Y, Fukuwalari Y, Okumura K, Takeda K, Ohno N, Mori K, ci al. Basic and clinical research on immunoregulatory activity of Agaricus blazei. Toko Igaku 2004;20:29-36.

23.Akanuma AM, Yamagishi A, Motoi M, Ohno N. Cloning and characterization of polyphenoloxidase DNA from Agaricus brasiliensis S. Wasser et al. (Agaricomycetideae). Jnt J Med Mushrooms 2006;8:67-76.

24.Hashimoto S, Akanuma AM, Motoi M, Imai N, Rodrignes CA, et al. Effect of culture conditions on chemical composition and biological activities of Agaricus braziliensis. Int J Med Mushrooms, под печат.

25.Furukawa M, Miura NN, Adachi Y, Motoi M, Ohno N. Effect of Agaricus brasiliensis on Murine Diabetic Model C57BI/Ksj-db/db. Int J Med Mushrooms 2006;8:115 -28.

26.Mukai H, Watanabe T, Ancio M, Katsumata N. An alternative medicine, Agaricus blazei, may have induced severe hepatic dysfunction in cancer patients. J Clin oncology 2006;36:808-10.

27.Christine KC, Mark AR, Jay Olshansky S. The price of succcss: health care in an aging society. Health aff 2002;21:87 -99.

28. Каnсkо H, Nakanishi K. Proof of the mysterious efficacy of ginseng: basic and clinical trials: clinical effects of medical Ginseng, Korean red Ginseng: specifically, its anti-stress action for prevention of disease. J Pharmacol Sci 2004;95:158-62.

29. lino K, Ohno N, Suzuki I, Sato K, Oikawa S, Yadomae T. Structure-function relationship of antitumor beta-l,3-glucan obtained from matted mycelium of cultured Grifola frondosa. Chem Pharm Bull 1985;33:4950-6.

30. Ohno N, Adachi Y, Suzuki I, Oikawa S, Sato K, Ohsawa M, et al. Antitumor activity of a beta-l,3-glucan obtained from liquid cultured mycelium of Grifola frondosa. J Pharmacobiodyn 1986:9:861-4.

31. Takcyama T, Suzuki I, Ohno N, Oikawa S, Sato K, Ohsawa M, et al. Host-mediated antitumor effect of grifolan NMF-5N, a polysaccharide obtained from Grifola frondosa. J Pharmacobiodyn 1987;10:644-51.

32. Suzuki I, Takcyama T, Ohno N, Oikawa S, Sato K, Suzuki Y, ct at. Antitumor effect of polysaccharide grifolan NMF-5N on syngeneic tumor in mice. J Pharmacobiodyn 1987;10:72-7.

33. Kodama N, Asakawa A, Inui A, Masuda Y, Nanba H. Enhancement of cytotoxicity of NK cells by D-Fraction, a polysaccharide from Grifola frondosa. Oncol Rep 2005; 13:497-502.

34. Kodama N, Komuta K, Nanba H. Effect of maitake (Grifola frondosa) D-Fraction on the activation of NK cells in cancer patients. J Med Food 2003;6:371-7.

35. Harada N, Kodama N, Nanba H. Relationship between dendritic cells and the D-fraction-induced Th-1 dominant response in BALB/c tumor-bearing mice. Cancer Lett 2003;192:181-7.

36. Kodama N, Komuta K, Nanba H. Can maitakc MD-fraction aid cancer patients? Altern Med Rev 2002;7:236-9.

37. Inoue A, Kodama N, Nanba H. Effect of maitake (Grifola frondosa) D-fraction on the control of the T lymph node Th-l/Th-2 proportion. Biol Pharm Bull 2002;25:536-40.

38. Masaki K, Hirotake K. Delayed cell cycle progression and apoptosis induced by hemicellulase-treated Agaricus blazei. Evid Based Complement Attentat Med 2006; под печат, има я онлайн.

39. Kasai HL, He M, Kawamura M, Yang PT, Deng XW, Munkanta M, el al. IL-12 production induced by Agaricus blazei fraction H (ABH) involves toll-like receptor (TLR). Evid Based Complement Altern Med 2004;1:259-67.

40. Inagaki N, Shibata T, Itoh T, Suzuki T, Tanaka H, Nakamura T. cl al. Inhibition of IgE-dependant mouse triphasic cutaneous reaction by a boiling water fraction separated from mycelium of Phellinus linleus. Evid Based Complement Altern Med 2005;2:369-74.

41. Al-Fatimi MAA, Julich W-D, Jansen R, Lindequisi U. Bioactive components of the traditionally used mushroom podaxis pistillaris. Evid Based Complement Altern Med 2006;3:87-92.

42. Andersson HC, Hajslova J, Schulzova V, Panovska Z, Hajkova L, Gry J. Agaritine content in processed foods containing the cultivated mushroom (Agaricus bisporus) on the Nordic and the Czech market. J Food Addit Contain 1999;16:439-46.

43. Schulzova V, Hajslova J, Peroutka R, Gry J, Andersson HC. Influence of storage and household processing on the agaritine content of the cultivated Agaricus mushroom. Food Addit Contain 2002;19:853-62.

44. Friederich U, Fischer B, Luthy J, Hann D, Schlatter C. Wurgler FE. The mutagenic activity of agaritine—a constituent of the cultivated mushroom Agaricus bisporus and its derivatives detected with the Salmonella/mammalian microsome assay (Ames Test). Z Lebensin Unters Forsch 1986; 183:85-9.

45. Papaparaskeva C, loannides C, Walker R. Agaritine does not mediate the mutagenicity of the edible mushroom Agaricus bisporus. Mutagenesis 1991 ;6:213-7.

46. Toth B, Gannett P, Rogan E, Williamson J. Bactcrial mutagenicity of extracts of the baked and raw Agaricus bisporus mushroom. In Vivo 1992;6:487-90.

47. Nagaokaa MH, Nagaoka H, Kondo K, Akiyama H, Maitani T. Measurement of a genofoxic hydrazine, agaritine, and its derivatives by HPLC with fluorescence derealization in the agaricus mushroom and its products. Chem Pharm Bull 2006;54:922-4.

48. Hajslova J, Hajkova L, Schulzova V, Frandsen H, Gry J, Andersson HC. Stability of agaritine – a natural toxicant of Agaricus mushrooms. Food Addit Contain 2002;19:1028-33.

49. Toth B. Carcinogenic fungal hydrazines. In Vivo 1991;5:95-100.

50. Toth B, Sornson H. Lack of carcinogenicity of agaritine by subcutaneous administration in mice. Mycopathologia 1984;85:75-9.

51. Toth B, Taylor J, Malison B, Gannett P. Tumor induction by 4-(melhyl)benzenediazonium sulfate in mice. In vivo 1989;3:17-22.

52. Stamets P. Notes on nutritional properties of culinary-medicinal mushrooms. Int J Med Mushrooms 2005;7:103-10.

53. Ohno N, Yadomac T. Mutagenic substances of Bupleuri radix, in traditional herbal medicines for modern times, Bupleurum species, scienlific evaluation and clinical applications. In: Sheng-Li (ed). CRC Taylor & Francis, 2006, 159-76.

54. Izumi S, Ohno N, Kawakita T, Nomoto K, Yadomac T. Wide range of molecular weight distribution of mitogenic substance(s) in the hot water exlract of a Chinese herbal medicine, Bupleurum chinense. Biol Pharm Bull 1997;20:759-64.

55. Ohtsu S, Izumi S, Iwanaga S, Ohno N, Yadomac T. Analysis of mitogenic substances in Bupleurum chinense by ESR spectroscopy. Biol Pharm Bull 1997;20:97 -100.

56. Kidd P. Thl/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease. Altern Med Rev 2003;8:223-46.

57. Okamoto M, Hasegawa Y, Hara T, Hashimoto N, Imaizumi K, Shimokata K, et al. T-helper type 1/T-helper type 2 balance in malignant pleural effusions compared to tuberculous pleural effusions. Chest 2005;128:4030-5.

58. Knutson KL, Disis ML. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunol Immunother 2005;54:721-8.

59. Sarangi I, Ghosh D, Bhutia SK, Mallick SK, Maiti TK. Anti-tumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived proteoglycans. Int Immunopharmacol 2006;6:1287-97.

60. Kim GY, Lee JY, Lee JO, Ryu CH, Choi BT, Jeong YK, et al. Partial characterization and immunostimulatory effect of a novel polysaccharide-protein complex extracted from Phellinus linteus. Biosci Biotechnol Biochem 2006;70:1218-26,

61. Ahn WS, Kim DJ, Chac GT, Lee JM, Вас SM, Sin JI, ct al. Natural killer cell activity and quality of life were improved by consumption of a mushroom extract, Agaricus blazei Murill Kyowa, in gynecological cancer patients undergoing chemotherapy. Int J Gynecol Cancer 2004;14:589-94.

62. Kaneno R, Fontanari LM, Santos SA, Di Stasi LC, Rodrigues FE, Eira AF. Effects of extracts from Brazilian sun-mushroom (Agaricus blazei) on the NK activity and Iymphoproliferative responsiveness of Ehrlich tumor-btaring mice. Food Chem Toxicol 2004;42:909-16.

63. Fujimiya Y, Suzuki Y, Oshiman K, Kobori H, Moriguchi K, Nakashima H, et al. Selective tumoricidal effect of soluble proteoglucan extracted from the basidiomycete, Agaricus blazei Murill, mediated via natural killer cell activation and apoptosis. Cancer Immunol Immunother 1998;46:147-59.

64. Bosch TM, Meijerman I, Beijnen JH, Schellens JH. Genetic polymorphisms of drug-metabolising enzymes and drug transporters in the chemotherapeutic treatment of cancer. Clin Pharmacokinet 2006;45:253-85.

65. Musana AK, Wilke RA. Gene-based drug prescribing: clinical implications of the cytochrome P450 genes. WMJ 2005;104:61-6.

66. Netea MG, Gow NA, Munro CA, Bates S, Collins C, Ferwerda G, et al. Immune sensing of Candida albicans requires cooperative recognition of mannans and glucans by lectin and Toll-like receptors. J Clin Invest 2006;116:1642-50.

67. Brown GD. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 2006:6:33 43.

68. Saijo S, Fujikado N, Furula T, Chung S, Kolaki H, Seki K, et al. Dectin-1 is required for host defense against Pneumocystis carinii but not Candida albicans. Nat Immunol 2007;8:39 46.

69. Sutherland AM, Wallcy KR, Russell J A. Polymorphisms in CD 14, mannose-binding lectin, and Toll-like receptor-2 are associated with increased prevalence of infection in critically ill adults. Crit Care Med 2005;33:638-44.

70. Mullighan CG, Heatley S, Doherty K, Szabo F, Grigg A, Hughes TP, et al. Mannose-binding lectin gene polymorphisms are associated with major infection following allogeneic hemopoietic stem cell transplantation. Blood 2002;99:3524 9.

---

[1] Bupleurum chinense, известна още като „заешко ухо”, широко използвана в традиционната китайска медицина (бел.пр.)