Ефектите на D-фракцията, полизахарид от Grifola frondosa върху туморния растеж, включват активиране на NK клетките

Biol. Pharm. Bull. 25(12) 1647—1650 (2002)

Клетките естествени „убийци” (NK) са директно цитотоксични за туморните клетки и играят главна роля в регулирането на имунния отговор. Ние проследихме нивата на цитотоксична активност на NK клетките при пациенти с рак, получаващи D-фракция, екстрахирана от гъби майтаке (Grifola frondosa). В продължение на една година нивата на цитотоксична активност останаха повишени. За да изясним механизмите на дълготрайното активиране на NK клетките по време на третиране с D-фракция, ние наблюдавахме туморния обем и нивата на IFN-γ и TNF-α в мишки C3H/HeN с MM46 рак, на които е прилагана D-фракция в продължение на 19 дни. D-фракцията забележимо потискаше туморния растеж, което съответстваше на повишено освобождаване на TNF-α и IFN-γ от клетките на далака и значително нарастване на TNF-α, експресиран в NK клетките. Това показва, че D-фракцията активира NK клетките още на 20-ия ден от третирането. Нещо повече, D-фракцията повишава интерлевкина, произхождащ от макрофагите (IL)-12, който служи за активиране на NK клетките. Тези резултати показват, че клетките NK не са отговорни само за ранните ефекти на D-фракцията върху туморния растеж, а също и за продължителния супресивен ефект на D-фракцията чрез повишаване на освобождавания от макрофагите IL-12.

Ключови думи: продукция на IL-12; макрофаги; клетки NK

Както съобщихме по-рано, екстрахираният от плодно тяло на гъбата майтаке (Grifola frondosa) (1—>3)-разклонен (1—>6)-β-глюкан, наречен D-фракция (Fig. 1), е модификатор на биологичния отговор (МБО) подобно на лентинана, открит в Letinus edodes.^1—3) Тези полизахариди засилват активността на такива имунокомпетентни клетки като макрофагите, Т-хелперните клетки и Т-цитотоксичните клетки, които атакуват туморните клетки. Свойствата на D-фракцията на МБО ни наведоха на хипотезата, че оралното й прилагане може да се окаже ефективно лечение за раково болните. Вече бе демонстрирано, че орално приложена D-фракцията намалява големината на тумора у мишки, без да предизвиква нежелани странични ефекти.²⁾ Ето защо, D-фракцията започна да се предлага като полезен за здравето продукт, чиято безопасност бе потвърдена от Consumer Product Testing Co. (New Jer­sey, U.S.A.) Ние вече проведохме един не рандомизиран клиничен опит за терапия с D-фракция на пациенти с белодробен рак и рак на гърдата в стадии II—IV⁴⁾ Наблюдавахме покачване на продукцията на IL-2 у пациентите, третирани с D-фракция, което подсказва, че макрофагите и T клетките са били активирани от D-фракцията. Освен това, бе открито, че D-фракцията е ефективна по отношение на инфекцията с HIV⁵⁾ (човешки имунодефицитен вирус) и листериоза⁶⁾ чрез подсилване на имунната система. Тези резултати показват, че системата от имунни отговори, чрез които D-фракцията усилва антитуморните ефекти зависи от адаптивния имунитет, свързан с активиране на цитостатичните Т клетки.

Клетките естествени убийци (NK) разпознават незабавно и лизират много различни туморни клетки и клетки, инфектирани с вируси без необходимост от предварително сенситизиране или зависещо от MHC разпознаване, което е различно от цитотоксичните клетки.⁷⁾ Pham-Nguyen et al. съобщават, че само ранният NK клетъчен отговор не е достатъчен за отстраняване на тумора и че за дълготрайна преживяемост при IL-12-генна терапия на чернодробен туморен модел се изискват както T клетки, така и NK клетки.⁸⁾ В наше клинично проучване ние също установихме, че D-фракцията активира клетките NK на пациенти с рак на белия дроб, гърдата и черния дроб за дълги периоди от време, надвишаващи една година (Таблица 1). За да проучим продължителността на активираност на NK клетките от D-фракцията, ние изпитахме NK клетъчната активация при мишки с MM-46 карцином, третирани в продължение на 19 дни с D-фракция. Данните в настоящата статия подкрепят критичната роля, която може да играе имунотерапията на пациентите с рак за активиране на техните NK клетки.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Материали. За установяване активността на човешки NK клетки бяха използвани, хром-51 (Daiichi Kagaku Yakuhin Co., Tokyo) и lymphopacel (d= 1.077) (IBL Co., U.S.A.).

Животни Бяха закупени мъжки C3H/HeN 4-седмични мишки (Japan Crea Co., Osaka), които бяха отглеждани в продължение на една седмица преди експеримента. По време на експеримента те получаваха храна и вода без ограничения.

Клетки. Карциномните клетки MM-46 ни бяха любезно предоставени от Dr. Kanki Komiyama. За таргетни клетки на човешките NK бяха използвани ⁵¹Cr маркирани K-562.

Приготвяне на D-фракцията. D-фракцията бе приготвена от сух прах от плодни тела на гъби майтаке (Grifola frondosa) (Yukiguni Maitake Co., Niigata) по метод, описан в наша предишна статия.⁶⁾ Нивото на LPS,съдържащо се във фракцията, бе определено с Endospecy ES-20S Set (Seikagaku Industry Co., Tokyo) Процентът на LPS в D-фракцията беше по-малко от 0.000007%. Преди експеримента с използване на макрофагната клетъчна линия RAW 264.7 D- фракцията бе третирана с polymixin B (30 μg/ml) в продължение на 2 часа.

Приложение на D-фракцията на пациенти с рак. Dr. Kiyoshi Komuta от Полицейската болница в Осака получи информирано съгласие от 8 пациенти с рак. Тези пациенти, които бяха между 43 и 74 години и имаха раково заболяване в стадии от ІІ до ІV. В продължение на 34 месеца те получаваха всеки ден по100 mg D-фракция през устата и се изпитваше тяхната NK активност.

Приложение на D-фракцията на мишки C3H/HeN с MM46 карцином. MM-46 ракови клетки (2X10⁶) бяха имплантирани в дясната подмишница на 5-седмични мъжки C3H/HeN мишки. 24 часа след това D-фракцията (дневна доза 5 mg/kg ) започна да се прилага ежедневно интраперитонеално (i.p.) на мишките с MM-46 карцином и това продължи 19 дни. Коефициентът на туморно инхибиране (T.I.R.) бе изчислен така: [1-(тегло на туморната маса от мишка, третирана с D-фракция)/( тегло на туморната маса от мишка, третирана с PBS)] X100.

Установяване на активността на човешките клетки NK. Клетки NK (1 X 10⁶) получени от кръв по метода на Conray-Ficoll ⁹⁾ бяха смесени в епруветка с 2X10^{7 51}Cr-маркирани клетки K-562 (таргетни клетки за NK клетките). След инкубиране в продължение на 1 час в клетъчния супернатант бе открито посредством γ-брояч освобождаване на ⁵¹Cr. NK активността бе изчислена така: NK активност (%) = [(експериментално освобождаване-спонтанно освобождаване) cpm/(максимално освобождаване- спонтанно освобождаване) cpm (третиране с 1n HCl)] X 100.

РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

Ефектът на D-фракцията върху растежа на MM46-карциномните клетки. На 20-ия ден от приложението на D-фракцията на мишките с MM-46 тумор, установихме, значително намаляване на туморния растеж в сравнение с този у мишките, на които бе приложен фосфатно буфериран солеви разтвор (PBS). Коефициентът (T.I.R.) бе 82% (Фиг. 2). Ефектът на D-фракцията бе проучен също при мишки C3H/HeJ, които не отговарят на LPS; T.I.R. бе 78%. Тези резултати показват, че D-фракцията инхибира туморния растеж.

Ефектът на D-фракцията върху активацията на клетките NK. Както вече бе съобщено, D-фракцията засилва клетъчния имунитет, стимулирайки такива клетки като макрофагите, Т хелперните клетки и цитотоксичните Т клетки.²⁾ За да установим, дали тя предизвиква активиране на NK клетките, ние изследвахме освобождаването на IFN-γ и TNF-α от цели далачни клетки на 20-ия ден от прилагането на D-фракция на мишки, като за целта използвахме IFN-γ и TNF-α ELISA набори (Genzyme Co., Minneapolis, U.S.A.). Както е показано на фигури 3A и 3B, нивата на IFN- γ и TNF- α нараснаха 1.5, респективно 2.5 пъти в сравнение с тези в контролните мишки. Проучихме също чрез флоу цитометричен анализ интрацелуларната експресия на TNF- α в далачни NK клетки след приложение на D-фракция. За да открием клетките NK, оцветихме 2X10⁶ клетки с R-PE-конюгирани PanNK и Cy-Chrom^TM– конюгирани CD3e антитела (PharMingen Co., San Diego, CA, U.S.A.). CD3e негативните и PanNK позитивните клетки представляваха NK клетки. За откриване на TNF-α експресията в NK клетките използвахме флуоресцин изотиоцианат (FITC) – конюгирано TNF-α антитяло (PharMingen Co.). След оцветяването, NK клетките, експресиращи TNF-α бяха анализирани посредством FACSCalibur аналайзер (Beckton Dickinson Co., Grenoble, France), а хистограмите бяха изчислени с CellQuest софтуер (Becton Dickinson, Mountain View, CA, U.S.A.).

На 20-ия ден от i.p. приложение на D-фракция (5 mg/kg/ден) или PBS (—) бяха взети спленоцити по методики , описани по-рано.⁶⁾ Спленоцитите бяха поставени в количество 1X10⁶ клетки/кладенче в 96-кладенчова плака и култивирани с Con A (10 mg/ml) на 37 °C за 24 часа при 5% CO₂. След активацията нивата на INF-γ и TNF-α в супернатанта на културата бяха отчетени посредством реакция ELISA. Данните бяха изразени като средно±S.E.M. за 4—8 експеримента. **, p<0.01; ***, p

Фиг. 3C. Ефекти на D-фракцията върху интрацелуларната експресия на TNF-α в NK клетки на мишки с MM-46 карцином

На 20-ия ден от i.p. приложение на D-фракция (5 mg/kg/ден) или PBS (—) бе изследвана интрацелуларната експресия на TNF-α в далачни NK посредством флоу цитометричен анализ. Показани са репрезентативни хистограми от трицветен флоу цитометричен анализ на места в далака, оцветени с R-PE-конюгирани PanNK, Cy-Chrom^TM-конюгирани CD3ε и FITC-c конюгирани TNF-α антитела.

Както е показано на Фиг 3C, в резултат от приложението на D-фракция в далачните NK клетки бе отбелязано 1.3-кратно нарастване на вътреклетъчната експресия на TNF-α в сравнение с контролните мишки.TNF-α е цитокин, освобождаван от активираните NK клетки по същия начин както IFN-γ^10,11). Освен цитотоксичност и способност да предизвиква директно хеморагична туморна некроза той има различни функции, свързани с възпалителни и цитотоксични реакции.¹²⁾ Ето защо, същественото нарастване в освобождаването на IFN-γ и TNF-α предполага активиране на NK клетките от D-фракцията.

Фиг. 4. Освобождаване на IL-12 от клетки RAW 264.7, стимулирани с D-фракция

Клетки RAW 264.7 (1X106 клетки/кладенче в 24-кладенчова плака) бяха стимулирани с D-фракция в продължение на 18 часа.

За да се отстрани каквато и да е възможна контаминация с LPS, D-фракцията беше третирана преди използването й с полимиксин В (30 μg/ml) в продължение на 2 часа.

След посоченото време на инкубация IL-12 бе определен в културелните супернатанти чрез реакция ELISA. Данните са изразени като средно ±S.E.M. от 3 експеримента. *, p

Таблица 1. Действия на NK клетките у пациенти с рак
Пациент		Третирания (100 mg D-фракция)
	Предиa) (дата)	Следa) (дата)
SCLC (дребноклетъчен белодробен карцином) (74 годишна жена, стадий III) SCLC (дребноклетъчен белодробен карцином) (54 годишен мъж, стадий III) Алвеоларноклетъчен карцином (54 годишна жена, стадий III-B) Пулмонарна аденоматоза (54 годишен мъж, стадий IV) Карцином на жлъчния мехур (48 годишна жена, стадий II) Бронхогенен рак (58 годишен мъж, стадий III-B) Мастокарцином (рак на гърдата) (43 годишна жена, стадий III) Паратироиден карцином (69 годишен мъж, стадий III-B)	23% (‘99.6) 1% (‘98.5) 24% (‘98.4) 21% (‘99.7) 28% (‘98.7) 26% (‘99.5) 30% (‘98.10) 23% (‘99.6)	44% (‘99.9), 51% (‘00.2) 42% (‘99.7), 47% (‘00.9) 48% (‘98.9), 44% (‘99.4), 42% (‘00.5), 44% (‘01.2) 42% (‘00.9), 47% (‘01.2) 40% (‘98.8), 39% (‘00.1), 48% (‘01.5) 33% (‘00.10), 39% (‘01.1), 31% (‘01.6) 47% (‘99.9), 53% (‘00.12) 38% (‘99.9), 44% (‘00.4), 62% (‘01.6)
a) Установена NK активност (%). Стандартно ниво на NK активност при човека 18—40%.

Ефектите на D-фракцията върху освобождаването на IL-12 от макрофагите. IL-12 е освобождаван от моноцитите и макрофагите цитокин, който е от критично значение за функционирането на NK и T клетките. Той индуцира освобождаването на IFN-γ както от NK, така и от T клетките.^12—14) Клетките NK могат да лизират много различни туморни клетки чрез екзоцитоза на перфорин съдържащи гранули и последващо образуване от перфорина на литични пори в мембраната на таргетните клетки. Наскоро бе съобщено, че активирането на NK клетките с IL-2 и IL-12 повишава свързването на перфорина с мембраната на прицелните клетки, което се последва от лиза на туморните клетки.¹⁵⁾ IL-12 се освобождава от моноцитите и макрофагите. За да проучим ефекта на D-фракцията върху освобождаването на IL-12 инкубирахме клетки от макрофагиална клетъчна линия RAW 264.7 с различни концентрации на D-фракцията и отчетохме секрецията на IL-12. При третиране на клетките с D-фракция (500—1000 μg/ml) за 24 часа, количеството на освободения IL-12 значително надхвърли базовите нива (0 μg/ml D-фракция) (Фиг. 4). Ефектът на D-фракцията върху продукцията на IL-12 беше също изучен in vitro при използване на перитонеални макрофаги от нормални C3H/HeJ мишки. При стимулиране на нормалните перитонеални макрофаги с D-фракция (500 μg/ml) за 24 часа, продукцията на IL-12 показа нарастване в сравнение с тази на контролата (данните не са показани). Тези резултати показват, че продължителният антитуморен ефект на D-фракцията може да се обясни с активиране на клетките NK чрез извлечен от макрофагите IL- 12 и T клетъчна активация. NK клетките могат да бъдат активирани допълнително от INF-γ, освободен не само от самите тях, но и от активирани Т клетки.

Ефект на D-фракцията върху активацията на NK клетките на пациенти с рак. Нашите данни, че D-фракцията е безопасна и няма никаква токсичност бяха потвърдени от Con­sumer Product Testing Co. След като получихме това потвърждение, ние проведохме един не рандомизиран клиничен опит, за да проверим ефекта на D-фракцията върху NK клетките на 8 пациенти с рак, които се съгласиха да участват в опита. Както е показано на Таблица 1, третирането с D-фракция засилва активността на NK клетките на тези пациенти 1.2—2.7 пъти. Въпреки че тези тестове бяха ограничени и бяха използвани в неконтролиран опит, резултатите показват, че D-фракцията ефективно активира NK клетките на болните от рак.

В заключение, D-фракцията, представлява важен МБО (модификатор на биологичния отговор) за NK клетките на болните с рак, което се осъществява чрез усилване освобождаването на IL-12 от макрофагите. Влияейки върху NK клетките, имунотерапията с D-фракция оказва ефект върху ранния антитуморен отговор, докато NK и T клетките са отговорни за дълготрайния антитуморен отговор. Въпреки че зависимостта на имунната система от клетките изисква по-нататъшно изучаване, нашите резултати показват също, че е възможна имунотерапия с различни агенти, които усилват активността на NK клетките на раково болните.

Благодарности. Искаме да благодарим на Dr. Kanki Komiyama от Института „Kitasato” за предоставянето на туморните клетки, които използвахме в нашето проучване, а също и на г-н Yasuo Ohdaira, ръководител на отдела за развитие на Yukiguni Maitake Co. , който ни достави гъбата майтаке.

ЛИТЕРАТУРА

1) Adachi K., Nanba H., Kuroda H., Chem. Pharm. Bull., 35, 262—270 (1987).

2) Hishida I., Nanba H., Kuroda H., Chem. Pharm. Bull., 36, 1819— 1827 (1988).

3) Nanba H., Hamaguchi A., Kuroda H., Chem. Pharm. Bull., 35, 1162— 1168 (1987).

4) Kodama N., Komuta K., Nanba H., Altern. Med. Rev., 7, 236—239 (2002).

5) Nanba H., Kodama N., Schar D., Turner D., Mycoscience, 41, 293— 295 (2000).

6) Kodama N., Yamada M., Nanba H., Jpn. J. Pharmacol., 87, 327—332 (2001).

7) Schattner A., Duggan D. B., Am. J. Hematol., 18, 435—443 (1985).

8) Pham-Nguyen K. B., Yang W., Saxena R., Thung S. N., Woo S. L., Chen S. H., Int. J. Cancer, 81, 813—819 (1999).

9) Kou K., Sawada S., Med. Tech., 21, 574—580 (1993).

10) Tchorzewski H., Acta Haematol. Pol., 25, 56—61 (1994).

11) Nagashima S., Mailliard R., Kashii Y., Reichert T. E., Herberman R. B., Robbins P., Whiteside T. L., Blood, 91, 3850—3861 (1998).

12) Haranaka K., Satomi N., Sakurai A., Int. J. Cancer, 34, 263—267 (1984).

13) Trinchieri G., Gerosa F., J. Leukoc Biol., 59, 505—511 (1996).

14) Lee S. M., Suen Y., Qian J., Knoppel E., Cairo M. S., Leuk Lymphoma, 29, 427—438 (1998).

15) Lehman C., Zeis M., Uharek L., Br. J. Haematol., 114, 660—665 (2001).

16) Ingber D., Fuzita T., Kishimoto S., Nature (London), 348, 555 (1990).