Споделете с приятел

Vaclav Vetvicka, Jana Vetvickova
University of Louisville, Department of Pathology, Louisville, KY, USA
All authors contributed equally.
Correspondence to: Dr. Vaclav Vetvicka. University of Louisville, Department of Pathology, 511 S. Floyd, Louisville, KY 40202, USA.
Email: vaclav.vetvicka@louisville.edu.

Начало: Ролята на глюканите в стимулирането на имунната реакция е изучавана от няколко десетилетия. В този доклад се фокусираме върху ефекта на орално приети глюкани от Майтаке и Шитаке върху имунната реакция.

Методи и материали: Измерихме фагоцитозата, активност на NK клетки и секреция н IL-6, IL-12, IFN-γ и С-реактивен протеин(CRP) след 14 дни орален прием на тестваните глюкани. Във всички реакции, за сравнение, се ползва активен хексоза-свързан компонент(АНСС).

Резултати: Открихме значителна стимулация на защитните механизми. Най-активна, при всички случаи, бе комбинацията Майтаке-Шиитаке. Следвана на второ място от самостоятелно Майтаке, и след това само Шиитаке и АНСС.

Заключения: Краткотрайния орален прием на природни имуномодулиращи глюкани от гъбите Майтаке и Шиитаке силно стимулира и клетъчния и хуморалния клон на имунните реакции. И активността е значително по-висока от тази при АНСС.

Ключови думи: Фагоцитоза; цитокини; NK клетки; Ц-реактивен протеин(CRP); глюкан

Въведение
През цялата човешка история, природните продукти са ползвани да лекуват и/или за профилактика на заболяванията. Природните [1,3]-β-D-глюкани, изолирани от дрожди, зърно и гъби, са добре изучени биологични модификатори на имунния отговор [виж доклад(1)]. α-глюкан-съдържащите субстанции също показват способности да подобряват имунните функции (2). Глюканите са изключително безопасни въглехидрати и са представители на група от химически хетерогенни полизахариди, съществуващи в разнообразни форми от молекули като глюкоза, свързана с няколко типа и клона разклонения.

Изследванията на връзката на глюканите с имунната реакция започват още преди 70 години с две стартови точки: едната с произход Европа и САЩ, и втората в Япония. Основани на историческата им употреба, Японските групи се фокусират върху изследване на глюкани, получени от гъби; докато Европейските и Американските групи изучават глюкани, изолирани от Saccharomyces cerevisiae.

Първоначалните проучвания върху глюканите водят до откриване на възможността им да стимулират фагоцитарната система, да подобряват основните защитни механизми и да увеличават резистентността към тумори. През няколкото последователни десетилетия проучвания на глюканите се затвърждава значителната им роля в стимулиране на защитните реакции срещу инфекции и рак[виж(3,4)]. В допълнение, по-късно са демонстрирани и няколко допълнителни важни ефекти, като намаление на стреса (5), хипогликемичен ефект, редуциране нивата на холестерола (6) и подобрение на улцерните колити(7). Друго предимство, при ползването на глюкани като специфични и неспецифични активатори на имунните реакции, е фактът, че са приложими при всички видове тествани досега – от земни червеи до хора (8).

Глюканите от Майтаке и Шиитаке са едни от най-добре изучените глюкани (9-15). Екстрактът от гъбите Майтаке, използван в нашето проучване е богат на β-глюкани, докато този от Шиитаке е богат на α-глюкани. Активната хексоза-свързана компонент(АНСС) е богата на α-глюкан хранителна съставка, отгледана на база култивиране на Шиитаке и други базидиомицети. Първоначалното приложение на AHCC, е свързано с понижаване на кръвното налягане, но по-късно е открит и значителния имуностимулиращ ефект(16-18).

Тъй като в предшестващи публикации, са споделяни значително объркващи резултати, решихме да оценим имуностимулиращите ефекти на екстракт от гъби Майтаке, Шиитаке прах и смес от Майтаке и Шиитаке , както и на АНСС.

Методи и материали
Животни. Женски 8-седмични мишки BALB/c, поръчани от лаборатория Джаксън (Bar Harbor, ME, USA). Работата с животните протече по протокола на Университета на Луисвил( IACUC). Умъртвяване на животните бе осъществено посредством СО2 асфикция.

Материали. Трипан блу, среда RPMI 1640, натриев цитрат, LPS, Лимулус лизат текс Е-токсат, полимиксин В и багрило Wright, получени от Сигма Хемикъл Ко. (St.Louis, MO, USA). Телешки серум(FCS) от лаборатории Hyclone( Logan, UT,USA).

Глюкани. MaitakeGold 404 (MTG404) е разтворим, богат на глюкани екстракт, изолиран от плодни тела на Майтаке (Grifola frondosa). Продуктът, който е глюкан-белтъчен комплекс, е получен посредством водна екстракция от плодни тела под налягане и при температура 100оС или повече за 30минути до час. След това се добавя алкохол към екстракта с концентрация от 20 до 60% обем, за да може да се отдели с филтрация. Получения така екстракт се концентрира с нагряване до премахване на остатъчния алкохол. Продуктът е хигроскопичен прах с кафяв оттенък, разтворим във вода, алкални разтвори и диметил сулфоксид с молекулна маса около 1000 kDa. MTG404 е произведен от Yukiguni Maitake Co. ( Niigata, Japan) и за този проект е поръчана от Tradeworks group Inc. ( Brattlebro, Vermont, VT, USA).

Шиитаке , използвана в това проучване под формата на прах от цели гъби и богата на α-глюкани, е получена от Gourmet Mushrooms, Inc. (Sebastopol, CA, USA). Гъбата е отгледана на кафяв ориз, изсушена и стрита до фин прах.

АНСС ( Amino-up Chemical Company, Sapporo, Japan) e налична на пазара добавка, богата на α-глюкан. Приготвена е посредством култивиране на Шиитаке и други Базидиомицети върху оризови трици и подлагайки културата на ензимна реакция, последвана от гореща водна екстракция и криогенно изсушаване.

Орално третиране. Мишките се третират орално два пъти на ден за 14 дни с 61.5µg/ден MaitakeGold 404, 820 µg/ден Shiitake, 820 µg Shiitake и 61.5 µg MaitakeGold 404 или 100µg AHCC. PBS служи като негативна контрола. Приложените дози в проучването съответстват на препоръчваните дневни човешки еквиваленти за всяка съставка.

Фагоцитоза. Техниката за използване на фагоцитоза в синтетични полимерни микросфери е описвана и по-рано(19,20). Периферни кръвни клетки се инкубират с 0.05mL от 2-хидроксиетил метакрилат( НЕМА; 5х108/mL). Епруветките се инкубират при 37оС за 60 мин, с постоянно разклащане. Намазките се оцветяват с багрило на Wright. Клетки с три и повече НЕМА частици се считат за положителни. Същите намазки се ползват и за определяне на клетъчните типове.

Оценка на цитокинова продукция. На края, кръвта се събира, приготвя се серума, филтрира се през 0.45 µm филтри и се тестват за присъствие на цитокини ( IL-6, IL-12 и IFN-γ) миши кит Quantikine, съответно за IL-6, IL-12 и IFN-γ (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Оценка продукцията на С-реактивен протеин(CRP). На края, кръвта се събира, приготвя се серума, филтрира се през 0.45 µm филтри и се тества за присъствие CRP, използвайки CRP кит(Helica, Santa Anna, CA, USA).

Анализ на NK клетки. Клетките на далака се изолират от далака на мишка посредством стандартни методи. Клетъчната суспензия се генерира при притискане на смления далак към дъното на петри с PBS. След елиминиране на еритроцитите с 10 минутна инкубация с дестилирана вода, и 5 отмивания със студен PBS, клетките се ресуспендират в PBS и се преброяват. Жизнеността се определя с Трипан блу сепарация. Само клетките с жизненост над 95% се ползваха за съответните експерименти. Спленоцитите ( 106/mL; 0.1 mL/well) се поставиха във 96 подходящи V-образни епруветки. И бяха измити 3 пъти със среда RPMI 1640. След отмиването, се получи 50 µL от таргетната YAC-1 клетъчна линия( три различни концентрации от таргетни клетки бяха ползвани за финала в отношение ефектор-мишена 10:1, 50:1 и 100:1). След завъртане 250хg за 5 минути, епруветките бяха инкубирани за 4 часа при 37оС. Цитотоксичната активност на клетките се определи с помощта на теста CytoTox 96 Non-Radioactive на Promega( Madison,WI,USA), съгласно инструкциите на производителя. 10 µL от лизирания разтвор бяха добавени в подходяща контролирана среда 45 минути преди края на инкубацията. Следващата стъпка беше разклащането на епруветките при 250хg за 5 минути, последвана от пренасяне на 50 µL супернатанта в 96 плоскодънни епруветки. След пренасянето на 50 µLвъв всяка среда, последва покриване и инкубиране за 30 минути на тъмно при стайна температура. Оптичната плътност бе измерена с помощта на STL ELISA апарат ( Tecan U.S., Research Triangle Park, NC) при 492nm. Специфичната клетъчно-медиирана цитотоксичност бе изчислена с ползването на формула: Процент – специфично клетъчно убийство(% цитотоксичност) = 100х[(OD492 експериментално – OD492 контролно) разделено(OD492 максимално – OD492 контролно)] както е описано в инструкциите на производителя, където контролно е таргетните клетки инкубирани в среда сами и максимално е стойността получена при таргетните клетки, лизирани с разтвор, предоставен в съответния кит.

Статистика. Критерият на Стюдънт бе използван за статистическия анализ на данните.

Резултати

Бе установен ефект на глюканите върху фагоцитарната активност на профилираните фагоцити. Необходимо е по-нататъшно сравнително обследване на различни глюкани и/или техни комбинации, за да може да се направи оценка как тези компоненти повлияват тази реакция. Сравнихме активностите на MaitakeGold 404, Шиитаке, MTG404-Шиитаке смес и АНСС върху фагоцитозата в синтетични микросфери с моноцити и неутрофили от перитонеална кръв (Фиг.1). С изключение на АНСС и неутрофилите , всички тествани проби значително повишават фагоцитозата. Най-значителния наблюдаван ефект е при комбинацията MTG404-Шиитаке.

След това се фокусирахме върху активацията на NK клетките. Човешки YAC-1 бяха инкубирани с клетки от миши далак, изолирани от животни, стимулирани с тестовите проби (Фиг.2). Данните ни показаха, че комбинацията от MTG404-Шиитаке и MaitakeGold 404 самостоятелно активират токсичността на NK клетките във всички тествани съотношения ефектор-мишена. АНСС бе активен само при най високото съотношение ефектор-мишена.

Ефектът върху клетъчния клон на имунната реакция бе последван от евентуално оценка на възможната активация на цитокиновата секреция. Серумът, получен от мишки, хранени с различни проби, беше съхранен при -80оС за не повече от една седмица. Данните обобщени на Фиг. 3 показват, че при всички проби, значително се стимулира секрецията на IL-6. Пробите с най-висока активност бяха комбинацията Майтаке-Шиитаке, следвана от MaitakeGold 404 самостоятелна. Различна беше ситуацията при тестване на IL-12. Само комбинацията MTG404-Шиитаке и Шиитаке самостоятелно оказаха значително влияние върху завишаването нивата на IL-12. Дори и пик два пъти над нивото на всеки друг глюкан и над три пъти нивото на PBS контролата (Фиг.4). Ефектите върху секрецията на IFN-γ са подобни на тези на IL-6 (Фиг.5). Не бе наблюдавано значително изменение в нивата на CRP по време на изследването (Фиг.6).

Ефект на глюканите - графика 1

Ефект на глюканите - графика 2

Дискусия

Преди повече от 40 години, β-глюканите са първите описани със способността си да модифицират имунния отговор и стимулиращи отхвърляне на тумори в мишките. Като много други природни имуностимулатори, те са класифицирани като „неспецифични“, заради факта, че техните молекулярни мишени не са известни и техните ефекти изглеждат като плеотропни. Независимо от това, в научната литература се доказва и взема под внимание активността на β-глюканите в животински туморни модели(4). През последните 30 години, в Япония, успешно се прилагат β-глюкани, добити от различни видове гъби, върху пациенти с рак (21).

Въпреки десетилетия на широко проучване, знанието за връзката между физикохимичните характеристики( молекулно тегло, степен на разклоняване, конформация или разтворимост) и имунологичната активност, все още е ограничено. Значително по-малко е и известно за връзката между α-глюканите и имунните реакции. Продължават и дискусиите дали дрождевите или гъбените глюкани са по-добри (или vice-versa). Много е и малък броя на проучванията, които да ги противопоставят директно, сравнявайки отделните глюкани. Загадката кой е по оптималния глюкан все още стои.

Индивидуално достъпните в търговската мрежа глюкани значително се различават по биологична активност и цена (22). Допълнителна информация може да бъде открита, но броя на глюканите, които са сравнявани директно все още е сериозно ограничен(23,24). В това проучване се фокусираме върху биологичните и имунологичните възможности на два отделни, получени от гъби и богати на глюкан полизахарида, MaitakeGold 404 (богат на β-глюкани) и Шиитаке(богат на α-глюкани), комбинацията от двата и богатия на α-глюкан АНСС.

Глюканите, обикновено, служат като стимулатори на клетъчния имунитет, по тази причина и фагоцитозата е избрания метод за характеризиране на ефектите на имунната реакция. За нашето проучване, използвахме 2-хидроксиетил метакрилат микросфери. Тези частици имат лек негативен заряд, което рефлектира в неспецифичното прикрепване към клетъчната мембрана (25).

Използвахме фагоцитозата и активността на NK клетките като модел на нашето проучване, комбинацията от MaitakeGold 404 и Шиитаке глюканите показват по-високи активности спрямо гъбените съставки поотделно или АНСС. Когато сравнихме тези глюкани директно MaitakeGold 404 винаги е по-активен, дори и при значително ниски дози.

В допълнение на директната активация на клетките, включени в имунните реакции, се наблюдава и имуностимулиращия ефект на природните молекули глюкан, които директно и/или индиректно предизвикват увеличаване на синтезата и секрецията на разнообразни цитокини. Различните глюкани значително се отличават в ефекта си върху цитокиновия синтез(26,27). По-рано показахме значителния ефект на глюкана MaitakeGold 404 върху цитокиновото формиране(28).

В настоящото проучване, открихме че комбинацията от MaitakeGold 404 и Шиитаке глюканите, значително подобрява продукцията и на трите тествани цитокина – IL-6, IL-12 и IFN-γ. При всички случаи MaitakeGold404 сама по себе си беше по-активна от Шиитаке. Тъй като продукцията на цитокини е много чувствителна на присъствието на LPS, замърсяването с LPS може да маскира истинския ефект на глюкана. По тези причини, използвахме проби без LPS( изпразнени с добавяне на 10µg/L полимиксин В) паралелно на нормалните проби. Нямаше значителна разлика в активността на нормалните и тези без LPS(не са посочени данни).

Работата ни върху нивата на CRP не показа значителни промени. Резултатите отговарят на наскоро публикувана работа за ефекта на глюканите върху нивата на CRP в слюнка при деца с хронични респираторни проблеми (Richter 1).

Нашето текущо проучване ясно демонстрира, че глюканът, получен от Майтаке, действа по същия механизъм като други високо активни глюкани, отговорни за стимулиране на имунните защитни реакции. А когато се комбинира с Шиитаке, получената MTG404-Шиитаке смес има дори и по-добри имунологична и биологична активност, отколкото самостоятелните глюкани или АНСС.

Литература

1. Vetvicka V, Novak M. eds. Biology and Chemistry of Beta Glucan, Vol. 2, Beta-glucan, Structure, Chemistry and Specific Application. Oak Park: Bentham Science Publ., 2013.
2. Roman BE, Beli E, Duriancik DM, et al. Short-term supplementation with active hexose correlated compound
improves the antibody response to influenza B vaccine. Nutr Res 2013;33:12-7.
3. Novak M, Vetvicka V. Beta-glucans, history, and the present: immunomodulatory aspects and mechanisms of action. J Immunotoxicol 2008;5:47-57.
4. Novak M, Vetvicka V. Glucans as biological response modifiers. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets
2009;9:67-75.
5. Vetvicka V, Vetvickova J. Immune enhancing effects of WB365, a novel combination of Ashwagandha (Withania somnifera) and Maitake (Grifola frondosa) extracts. N Am J Med Sci 2011;3:320-4.
6. Rahar S, Swami G, Nagpal N, et al. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J
Adv Pharm Technol Res 2011;2:94-103.
7. Lavi I, Levinson D, Peri I, et al. Orally administered glucans from the edible mushroom Pleurotus pulmonarius
reduce acute inflammation in dextran sulfate sodiuminduced experimental colitis. Br J Nutr 2010;103:393-402.
8. Vetvicka V, Sima P. β-Glucan in invertebrates. Inv Surv J 2004;1:60-5.
9. Mizuno T, Zhuang C. Maitake, Grifola frondosa, pharmacological effects. Food Rev Int 1995;11:135-49.
10. Kodama N, Yamada M, Nanba H. Addition of Maitake D-fraction reduces the effective dosage of vancomycin for the treatment of Listeria-infected mice. Jpn J Pharmacol 2001;87:327-32.
11. Lin H, She YH, Cassileth BR, et al. Maitake betaglucan MD-fraction enhances bone marrow colony
formation and reduces doxorubicin toxicity in vitro. Int Immunopharmacol 2004;4:91-9.
12. Deng G, Lin H, Seidman A, et al. A phase I/II trial of a polysaccharide extract from Grifola frondosa (Maitake
mushroom) in breast cancer patients: immunological effects. J Cancer Res Clin Oncol 2009;135:1215-21.
13. Rincão VP, Yamamoto KA, Ricardo NM, et al. Polysaccharide and extracts from Lentinula edodes:
structural features and antiviral activity. Virol J 2012;9:37.
14. Ina K, Kataoka T, Ando T. The use of lentinan for treating gastric cancer. Anticancer Agents Med Chem
2013;13:681-8.
15. Finimundy TC, Gambato G, Fontana R, et al. Aqueous extracts of Lentinula edodes and Pleurotus sajor-caju exhibit high antioxidant capability and promising in vitro antitumor activity. Nutr Res 2013;33:76-84.
16. Ulbricht C, Brigham A, Bryan JK, et al. An evidence-based systematic review of active hexose correlated compound (AHCC) by the Natural Standard Research Collaboration. J Diet Suppl 2013;10:264-308.
17. Daddaoua A, Martínez-Plata E, Ortega-González M, et al. The nutritional supplement Active Hexose Correlated Compound (AHCC) has direct immunomodulatory actions on intestinal epithelial cells and macrophages involving TLR/MyD88 and NF-κB/MAPK activation. Food Chem 2013;136:1288-95.
18. Shigama K, Nakaya A, Wakame K, et al. Alleviating effect of active hexose correlated compound (AHCC) for anticancer drug-induced side effects in non-tumor-bearing mice. J Exp Ther Oncol 2009;8:43-51.
19. Vĕtvicka V, Fornůsek L, Kopecek J, et al. Phagocytosis of human blood leukocytes: a simple micromethod. Immunol Lett 1982;5:97-100.
20. Vĕtvicka V, Holub M, Kovárů H, et al. Alpha-fetoprotein and phagocytosis in athymic nude mice. Immunol Lett 1988;19:95-8.
21. Hazama S, Watanabe S, Ohashi M, et al. Efficacy of orally administered superfine dispersed lentinan (beta-1,3-glucan) for the treatment of advanced colorectal cancer. Anticancer Res 2009;29:2611-7.
22. Vetvicka V, Vetvickova J. β-1,3-Glucan: silver bullet or hot air? Open Glycoscience 2010;3:1-6.
23. Vetvicka V, Vetvickova J. An evaluation of the immunological activities of commercially available β-1,3-
glucans. J Am Nutr Assoc 2007;10:25-31.
24. Vetvicka V, Vetvickova J. Physiological effects of different types of beta-glucan. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2007;151:225-31.
25. Vĕtvicka V, Fornůsek L. Polymer microbeads in immunology. Biomaterials 1987;8:341-5.
26. Adachi Y, Okazaki M, Ohno N, et al. Enhancement of cytokine production by macrophages stimulated with
(1–>3)-beta-D-glucan, grifolan (GRN), isolated from Grifola frondosa. Biol Pharm Bull 1994;17:1554-60.
27. Hirata N, Tsuzuki A, Ohno N, et al. Cytokine synthesis of human monocytes stimulated by triple or single
helical conformer of an antitumour (1–>3)-beta-Dglucan preparation, sonifilan. Zentralbl Bakteriol 1998;288:403-13.
28. Vetvicka V, Vetvickova J. Immunostimulating properties of two different )-β-glucans isolated from Maitake mushrooms (Grifola frondosa). JANA 2005;8:33-9.

Cite this article as: Vetvicka V, Vetvickova J. Immuneenhancing effects of Maitake (Grifola frondosa) and Shiitake
(Lentinula edodes) extracts. Ann Transl Med 2014;2(2):14. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2014.01.05


Споделете с приятел